Вязка хомута: Шарф-хомут спицами — ТОП-140 фото вариантов красивых хомутов спицами. Пошаговый мастер-класс для начинающих с простыми вязальными схемами

Шарф-хомут спицами — ТОП-140 фото вариантов красивых хомутов спицами. Пошаговый мастер-класс для начинающих с простыми вязальными схемами

Шарф-хомут (или как его часто называют — снуд) — предмет одежды, который годами не выходит из моды, а его вариаций становится все больше. Снуд выполняет не только функцию шарфа, но и головного платка и даже накидки. Шарф-хомут, связанный спицами, — функциональный и элегантный аксессуар для зимы и холодной осени, который носят женщины, мужчины и дети.

Содержимое обзора:

Разновидности шарфа-хомута

В зависимости от того, как укладывается изделие на шее, выделяют следующие варианты:

• широкий шарф-хомут дважды оборачивают вокруг шеи, он лежит свободно, заднюю часть можно приподнять и надеть на голову как платок, вяжется как длинный шарф и сшивается на концах;
• снуд небольшого диаметра в один оборот надевают через голову, чаще всего вяжут такой шарф-хомут круговыми спицами;
• различные декоративные вариации шарфа-хомут, например, перекрученный снуд («лента Мебиуса») — стильный аксессуар с двусторонним узором.

Вариантом снуда может быть хомут, совмещенный с капюшоном — в месте шва или любом другом месте противоположные части изделия сшиваются на длину примерно 30 см (комфортная высота от плеч до макушки). Сзади капюшон укладывается как худи.

Инструменты и пряжа

Спицы для изделия средней плотности берутся № 3. Можно использовать разные инструменты в зависимости от техники вязания — две, круговые или пять спиц (чулочные). Толщина (номер) инструмента подбирается под толщину пряжи.

Популярны хомуты, связанные из толстых нитей — получается мягкий шарф с объемной, немного рыхлой структурой, инструмент берется примерно от № 5 до № 9. Также важно учитывать плотность, с которой обычно вяжет мастерица, — изделие не должно получится слишком тугим или рыхлым.

При выборе материала нужно помнить, что снуд постоянно касается шеи и лица, — не следует брать пряжу, которая может вызвать раздражение, она должна быть мягкой и комфортной.

Если изделие сшивается, понадобится крючок или толстая игла с широким ушком (можно взять специальную иглу для трикотажа). Шарф-хомут украшают бусинами, пуговицами в тон или, напротив, контрастными по цвету.

Шарф-хомут английской резинкой

Такой снуд отлично подойдет для начинающих вязальщиц — он вяжется быстро и просто. Рельефная резинка создает структурную поверхность, модную уже несколько сезонов.

Итак, мастер-класс, как вязать шарф-хомут, начинается с выбора инструмента и пряжи. На этикетке к каждому мотку даются рекомендации по размеру спиц — на это и следует ориентироваться в первую очередь.

В данном случае резинка не простая, а эффектная английская резинка, точнее, ее упрощенный вариант. У нее несколько названий — ленивая, ложная, фальшивая. Она проще классической английской, но не менее привлекательна. Раппорт (повторение узора) резинки кратен четырем петлям и двум рядам в высоту:

• 1 р.: 3 лицевые, 1 изнаночная, повторять до конца ряда;
• 2 р.: 2 лиц., 1 изн., 1 лиц., повторять.

Обратите внимание!

Первый и второй ряд чередуют, пока не будет достигнута нужная длина.

Перед началом вязания делается образец, чтобы понять, сколько петель потребуется набрать для определенной ширины и с какой плотностью вязать. Образец выполняют тем же узором, что и готовое изделие. В данном случае набирают 14 петель — 12 для основного рисунка (кратно четырем) плюс две кромочные — и вяжут в высоту несколько сантиметров.

Берется, к примеру, пряжа 30 % мериносовая шерсть, 70 % акрил, 100 метров в одном мотке весом 100 грамм, две прямые спицы № 6. Идеальное сочетание шерсти и синтетики — хомут получится мягким, но теплым.

Для снуда шириной примерно 40 см набирают 72 петли и две кромочные и вяжут в высоту до 150 см. Работу закрывают, два конца соединяют крючком или трикотажной игрой. На изделие указанной ширины потребуется примерно 6 (неполных) мотков.

Шарф-хомут «под жемчуг»

Простой и элегантный жемчужный узор иногда еще называют «рисом» — вязаное полотно напоминает и мелкий жемчуг, и зерна риса. Изделие вяжется поворотными рядами.

Набрать 60 петель плюс две кромочные. Схема вязания шарфа-хомута спицами жемчужным узором очень проста. Раппорт равен двум петлям и четырем рядам:

Обратите внимание!

• 1 р.: 1 лиц., 1 изн., повторять до конца ряда;
• 2 и 4 р.: вязать по рисунку;
• 3 р.: 1 изн., 1 лиц., повторить.

Двусторонний рисунок вывязывается в шахматном порядке, именно поэтому поверхность зернистая — отличный вариант для перекрученного снуда «лента Мебиуса» из однотонной или меланжевой пряжи.

Снуд с косами

Косы — излюбленный узор вязальщиц: они благородно смотрятся, такие изделия теплее и в меньшей степени подвержены деформации благодаря плотности кос. Иногда их называют жгутами и аранами. Вариантов кос великое множество, в данном случае коса состоит из 12 петель, количество кос — пять. Потребуется вспомогательная спица (переходник).

Шарф-хомут вяжется со швом, поэтому на готовом изделии косы будут лежать горизонтально. На прямые спицы набирают 76 петель плюс две кромочные, всего 78. Основной рисунок состоит из нескольких элементов:

• косы вяжутся чулочной вязкой, то есть все нечетные ряды провязываются лицевыми, четные — изнаночными;
• платочная вязка — все ряды провязываются лицевыми;
• изнаночная гладь — все нечетные ряды провязываются изнаночными, четные — лицевыми.

Раппорт состоит из 12 петель и 12 рядов:

• 1 р.: 4 петли платочной вязкой, *12 петель чулочной вязкой, 2 петли изнаночной гладью*, повторить от* до * еще три раза, 12 чулочной вязкой, 4 платочной вязкой;
• со 2 по 4 ряд вязать по рисунку;
• 5 р.: 4 платочной вязкой, *4 петли снять на вспомогательный переходник перед работой, 4 лиц., 4 лиц. с переходника, 4 лиц.*, повторить от* до * еще четыре раза, далее по рисунку;
• с 6 по 10 ряд вязать по рисунку;
• 11 р.: 4 платочной вязкой, *4 лиц., 4 снять на вспомогательный переходник за работой, 4 лиц., 4 лиц. с переходника*, повторить от* до * еще четыре раза, далее по рисунку;
• 12 р.: вязать по рисунку.

Повторяя раппорт, можно связать длинный шарф-хомут в два-три оборота либо сделать миниатюрный аксессуар в один оборот. Особенно хорошо косы смотрятся из однотонной пряжи.

Обратите внимание!

Снуд круговыми спицами

Преимущество шарфа-хомута, связанного по кругу, в отсутствии шва. Однако, бесшовные снуды иногда плохо держат форму, их перекручивает, поэтому вязать нужно поплотнее.

Лучше всего по кругу вязать небольшие хомуты в один оборот. Если нет круговых, можно взять пять коротких прямых спиц и вязать по принципу вязания носок.

Для женщин

Связать шарф-хомут круговыми спицами проще простого, если подобрать инструмент с правильной длиной лески. Узор вяжется по кругу. Такая разновидность снуда напоминает трубу, иногда аксессуар так и называют.

Изделие, связанное простой чулочной вязкой, украшают пуговицами, бусинами или даже вышивкой. Начать и закончить можно классической резинкой (две лицевые, две изнаночные) высотой 4 см.

Еще один лаконичный узор — широкая плоская резинка с раппортом «четыре на четыре». Такое изделие из мохеровой пряжи будет смотреться благородно и интересно за счет фактурного материала.

Для мужчин

Для мужских снудов обычно берутся темные или неброские оттенки: серый, темно-синий, черный, коричневый. Если связать шарф-хомут резинкой «два на два» по кругу, получится отличный аксессуар для мужчины в один оборот.

Интересно на мужчинах смотрятся модели рыхлой вязки с двумя оборотами. Крупный лаконичный рисовый узор выглядит одновременно и универсально, и стильно.

Для детей

Как связать шарф-хомут спицами для ребенка? Точно так же, как для взрослого: сама техника вязания ничем не отличается, просто размер будет меньше и расход материала будет небольшим.

Можно взять специальную пряжу с маркировкой «Для детей» — она мягкая, встречаются яркие расцветки. Детские снуды делаются, как правило, с одним оборотом.

Оригинальные модели

В сети Интернет можно найти большое количество фото шарфов-хомутов, которые отличаются особой оригинальностью, выделяются декоративностью или техникой вязания.

Шарф-хомут на завязке

Этот снуд интересен тем, что он достаточно широк, чтобы его можно было натянуть на плечи и использовать в качестве накидки. Шнурок нужен, чтобы регулировать ширину снуда на шее.

Для изготовления лучше взять мягкую объемную пряжу с высоким содержанием синтетики, круговые спицы № 6-9 в зависимости от толщины нити и плотности вязания, а также маркер (специальные цветные пластиковые булавки или обычную английскую булавку). Рисунок будет вертикальным.

Узор с косами:

1. Связать образец и определить с размерами. Количество петель должно быть кратно 12. Перед тем, как провязать первый круг и замкнуть его, в начале ряда нужно установить маркер.
2. Вязать резинкой «два на два» 5 сантиметров в высоту.
3. Начать новый рисунок над двумя лицевыми петлями предыдущего круга, чтобы косы как бы «вырастали» из резинки: на косе *3 петли снять на вспомогательный переходник перед работой, провязать 3 лиц., затем 3 лиц. с переходника, 6 изн.*, повторять от * до *. Так провязать весь круг.
4. Следующие три круга вязать *6 лиц., 6 изн.*, повторять от * до *.
5. Повторять пункты 3 и 4 до достижения нужной высоты, не забывая переставлять маркер выше по полотну. Высота изделия зависит от того, насколько глубоко снуд будут надевать на плечи плюс высота шеи.
6. Завершить резинкой 5 см.
7. Протянуть шнурок примерно на уровне первого ряда резинки в верхней части. Шнурок можно сделать из готовой тесьмы подходящего цвета или связать его крючком из остатков пряжи.

Если шнурок не затягивать туго, объемный шарф-хомут будет свободно лежать по плечам.

Снуд-шнурок

Из названия видно, что это узкое изделие, которое по большей части выполняет декоративную функцию. Для него лучше взять фасонную пряжу средней толщины, например, с редкими вкраплениями люрекса, и прямые спицы.

Ширина снуда составляет примерно 20 см. С помощью предварительно связанного образца рассчитывают требуемое количество петель. Для узкого шарфа-хомута можно попробовать простой ажур.

Основной узор (кратность 4+1 петля+2 кромочные):

• 1, 5 и все четные ряды: чулочная вязка;
• 3 р.: 2 лиц., * накид, 2 петли провязать вместе лицевой, 2 лиц.*, повторять от * до *, закончить ряд одним накидом, 2 петли вместе лицевой, 1 лиц.;
• 7 р.: 2 лиц., *2 лиц., накид, 2 вместе лицевой*, повторять от*до *, закончить тремя лицевыми.

Раппорт завершается восьмым рядом, и его повторяют, пока длина полотна не достигнет примерно 180 см. С длиной можно окончательно определиться во время примерки.

Такой снуд-шнурок носят, обмотав два-три раза вокруг шеи. Аксессуар с простым, но благородным ажурным узором смотрится роскошно и небрежно одновременно.

Вязание спицами шарфа-хомута — интересное и полезное занятие, ведь в итоге получается модная и функциональная вещь с высокими декоративными характеристиками. Такой аксессуар могут связать даже неопытные вязальщицы, главное — правильно подобрать инструменты и материал и запастись терпением.

Фото шарфа-хомута спицами

хомут спицами, 22 модели с описанием и спицами, Вязание для детей

Вязаный спицами, крючком или даже пальцами шарф в виде кольца называют хомутом, снудом, трубой. Этот стильный, легкий, объемный аксессуар имеется в гардеробе каждой модницы. Кроме того, снуд отлично согревает, может использоваться не только как шарф, но также выполнять функции шапки, и даже жилета. В магазинах можно приобрести разнообразные по размеру, форме, цвету модели. Но всегда трендовыми остаются вещи, изготовленные собственноручно.

Содержание статьи

Умеешь вязать спицами?
Опубликуй работу
на knitka.ru

Разновидности и способы вязки шарфа-хомута спицами

Есть несколько вариантов:

• широкое простое кольцо, подразумевается, что такой шарф-хомут будет дважды охватывать шею, ложась свободно на плечи; одну его часть можно надеть на голову;
• простое кольцо маленького диаметра, носится в один оборот.
• «лента Мебиуса» – концы такого изделия сшивают, предварительно один раз перекрутив его; считается, что этот вид плотнее прилегает к шее;
• плотно прилегающие, имеющие малый диаметр и застегивающиеся на пуговицы.

Первый вариант шарфа-хомута можно вязать либо обычными спицами до нужной длины, затем сшивая концы, либо круговыми, заранее набрав на них необходимое для длины количество петель. В последнем случае сшивать ничего не понадобится.

Для «ленты Мебиуса» потребуется подобрать двусторонний узор. Самый простой вариант – резинка. Можно также использовать платочную вязку.

Шарф-хомут не обязательно должен быть очень длинным. Есть модели, предусматривающие только одно кольцо. Они могут быть выполнены в виде капюшона, который при необходимости надевают на голову.

Необходимые материалы и приемы вязания

Шарф-хомут может стать одним из первых изделий, связанных спицами, – настолько просто это делается. Необходимо лишь знать самые азы – приемы набора петель, как вяжутся лицевые и изнаночные петли.

Пряжа используется разная, от толстых ниток до мохера и даже плотных, тонких, из которых получится демисезонное изделие. Главное, чтобы они были мягкими и эластичными, хорошо держали форму.

Хотя процесс очень прост, для начала следует выбранными спицами связать образец, чтобы точно рассчитать необходимую ширину и длину шарфа-хомута.

Шарф – хомут спицами, модели с нашего сайта

Комплект Первые морозы (шарф – хомут и шапка)

Автор Екатерина katknit. Работа прислана на конкурс “Шапки и комплекты”. Материалы – пряжа секционного крашения Big Delight от Drops (100% шерсть, 190м/100гр) 250гр на шапку (размер 56-58), снуд в один оборот и митенки (у меня с

Читать дальше…

Комплект Меланж (шапочка и шарф – хомут)

Комплект “Меланж”. Работа прислана на наш конкурс по вязанию “Шапки и комплекты”. Пряжа “Nako Bambino Marvel”, 25% шерсть, 75% акрил, 100 гр – 350 м, ушло три мотка. На окружность головы 56 см, спицы прямые 2 мм.

Читать дальше…

Шапочка и шарф – хомут для девочки

Комплект, шапочка и снуд, связан спицами. Шапочка двойная. Подклад связан лицевой гладью из той же пряжи. Размер шапочки 55 -58. Высота шапочки 23 см. Помпон – песец. В узоре использована коса. Раппорт узора состоит из 14 петель. Всего 11

Читать дальше…

Шапка и шарф – хомут

Шапка теплая зимняя со снудом из пряжи ALIZE LANAGOLD 800 CLASSIC, состав пряжи 51% акрил, 49 % шерсть. Комфортна в носке, не колется. Узор из смещенных рядов изнаночной и лицевой глади смотрится оригинально. Подходит для

Читать дальше…

Берет, варежки и шарф-хомут в технике энтрелак

Здравствуйте! После временного отсутствия вернулась в свой дневничок) В последнее время увлеклась техникой “Энтрелак”. техника не нова, но захватывает сильно! Да и вещи получаются интересные, нескучные, не безликие, а очень даже привлекательные) Берет, варежки, снуд – связались на

Читать дальше…

Шарф – хомут спицами, работа Ларисы Глебовны

Снуд связан спицами из пряжи Великолепная Пехорка, зимняя серия. Длина нити, метров: 300; состав: 30% ангора, 70% акрил высокообъёмный. Вес мотка, грамм: 100. Потребуется 3 моточка и спицы №4. Набираем 80 петель. Вяжем ленивой английской резинкой. 1 ряд:

Читать дальше…

Как связать шарф – хомут с косами

Зимний, женский комплект (шапка, варежки, снуд). Комплект связан в технике градиент. Пряжа BRILLIANT (состав: 45 % шерсть ластер, 55% акрил. Длина нити 380 м.) в три нити. Спицы № 5. Ширина косы 12 петель. Расход

Читать дальше…

Комплект Вивьен от Shayta (шапка, митенки и шарф – хомут)

Авторская работа Оксаны Усмановой. Всем здравствуйте! Комплект “Вивьен” выполнен из пряжи Аляска (16%-верблюжья шерсть, 24%-шерсть, 60%-акрил), 204м-100гр. На комплект использовала 2,5 мотка, спицы круговые № 3,5 и чулочные – № 3(для макушки и митенок), меховой помпон,

Читать дальше…

Шарф – хомут и берет, работа Irene IVAS

Комплект “Майра” (из оригинального описания). Размеры Берет и снуд: S/M – L/XL Высота снуда 24 см и окружность 84-91 см по нижнему краю и 57-62 см по верхнему краю. Материалы: Пряжа DROPS LIMA (65% шерсть, 35% альпака, 50 г/100

Читать дальше…

Комплект: шапочка и шарф – хомут для девочки

Комплект “Шапочка и снуд” связаны спицами одним узором. Пряжа 50% шерсть и 50% акрил. В 100гр – 300 м. Работы Валентины Литвиновой.   Резинка шапочки двойная связана спицами диаметром 2 мм., шапочка – спицами диаметром 3 мм. Шапочка

Читать дальше…

Вяжем шарф-хомут спицами, работа Ларисы Величко

Снуд,вязаный спицами-работа Ларисы Величко. С вязанием данного снуда справится даже новичок. Для вязания я использовала пряжу Brilliant фирмы Vita(в 3 нити), прямые спицы 4,5 и очень простой рисунок “рис”(на всякий случай предоставляю схемку) Набираем 60 петель и вяжем рисунком “рис ” 140см. Далее сшиваем швом “петля в петлю”.

Схема узора для шарфа – хомута

• Вяжем шапки и шарфы спицами, подборка комплектов

Как связать шарф – хомут спицами, идеи из интернет

Интересные схемы и описания для вязания спицами модных снудов и шарфов для женщин и детей.

Комплект из шапки-бини и шарф – хомут спицами

Инструменты и материалы: спицы № 4 – 4,5, пряжа терракотовая шерстяная или полушерстяная 50 г 90-100 м (200 грамм), остатки пряжи, подходящие по цвету для цветных полос (около 100 грамм). Можно использовать остатки пряжи.

Автор работы Инна Сидорова.

Описание комплекта на русском можно скачать по ссылке

Как связать спциами шарф – хомут из итальянской пряжи

Метраж пряжи: 1500 м. /100 грамм; состав 90 % меринос экстрафайн +10 % ангорки.

Описание узора для шарфа – хомута

1 ряд: * 1 лицевая, 1 п. снять непровязанной-нить ЗА работой*-повторять до конца ряда, в конце ряда 1 лицевая.
2 ряд: все петли провязать лицевыми.
3 ряд: 1 лицевая, * 1 лицевая, 1 п. снять непровязанной-нить ЗА работой*-повторять до конца ряда, в конце ряда 1 лицевая.
4 ряд: все петли провязать лицевыми.

Повторять с 1 по 4 ряд.
Узор формируется на изнаночной стороне работы.
Главное, не вяжите снуд слишком плотно, возьмите спицы толще, чем того требует толщина нити.

Как связать ажурный шарф – хомут спицами

Нам понадобится:

• пряжа (65% шерсть, 35% хлопок, 55 м на 100 гр.) – 6 моточков;
• круговые сп. № 6,5, длина – 60 см;
• маркер
• трикотажная игла;
• три пуговицы диаметром 2,5 см.

Плотность составит 14 п. х 20 р. = 10 х 10 см ажурным рисунком или 12 п. х 20 р = 10 х 10 см лицевой гладью.

Изделие будет 65 см в длину и 20,5 см в ширину.

Описание и схемы вязания спицами шарфа – хомута

Как связать модный шарф – хомут спицами

Схема для снуда “Рыбий хвост”

Fishbone snud – мужской шарф – хомут спицами

Ментоловый шарф – хомут спицами

Размеры: окружность 174 см, высота 21.6 см.
Пряжа O’Wool Legasy Bulky ( 100% органическая мериносовая шерсть, 97м/100гр) 4 мотка.

Плотность вязания:

• 9.25п*16р= 10см узором «рис»;
• 29п узора с косами = 19см.

Сохраните свое время, проверьте свою плотность вязания спицами.
Шарф – хомут связан прямыми спицами 8 мм.
Дополнительно: маркеры, крючок 8мм, дополнительная спица 8мм, игла, остатки пряжи для набора петель.

Видео – уроки по вязанию спицами шарфа – хомута

Подробные и хорошие мастер – классы по вязанию спицами, выбирайте!

Шарф – хомут спицами с косами, мастер – класс

Снуд я также буду вязать из пряжи YarnArt. Расход пряжи на снуд – немного больше 2 мотков. Спицы в работе использованы № 4,5. Также в помощь при вязании кос Вам потребуется вспомогательная спица.

Здесь должно загрузиться видео, подождите или обновите страницу.

Самый простой шарф-хомут из перуанской шерсти

Вам понадобится всего 1 моток пряжи Rainbow wool и спицы № 12. Состав: 100% шерсть высокогорных перуанских овец. Вес: 200 гр. Длина нити: 80 м. Производится в Перу. Толщина нити: 8 мм.

Здесь должно загрузиться видео, подождите или обновите страницу.

Вяжем шарф – хомут спицами, урок для начинающих

Для вязания вам понадобится пряжа Kartopu Punto. Состав: 80% Акрил, 20% Полиамид. Метраж: 110 м. Вес мотка: 100 гр. Спицы – №-3-4. Крючок – №-4,5. Изготовитель: фабрика Картопу Турция. Толстый, мягкий, теплый и гипоаллергенный акрил.
Здесь должно загрузиться видео, подождите или обновите страницу.

Снуд спицами рельефной резинкой

Пряжа Alize Baby wool, цвет 52. Спицы: 2,5 мм. Размеры: высота 35 см, ширина в объеме 62 см. Расход: 125 гр.
Здесь должно загрузиться видео, подождите или обновите страницу.

Схемы вязания хомута на спицах — топ 10 моделей

Хомут – удобный вязаный аксессуар, который можно использовать как шарф, а так же при необходимости накинуть на голову в качестве головного убора. Для вас я подобрала несколько схем вязания хомута на спицах. Смотрите, выбирайте подходящую модель и вяжите!

Эффектный хомут с орнаментом

Модель шарфа хомута разработана дизайн студией Дропс.
Габариты: 36 на 98 см.
Приготовьте:
– пряжу Alaska Drops (100% шерсти, 70мет/50гр) – 150 гр светло серого, 50 гр розового и 50 гр голубого цвета;
– спицы на леске №5 и крючок №6.
Плотность: 17 п. = 10 см.
Убавления: убавляйте по 1 п. до и после маркера след. образом: 1 п. снимите как лицевую, 1лиц., протяните ее через непровязанную, маркер, 2 вместе лицев.

Схема и описание вязания шарфа хомута на спицах:

1. На спицы наберите 168 п. (кратно 4) голубой нитью. Перейдите на светло-серый цвет и свяжите 1 р. лицевыми п. Далее объедините работу в кольцо и вяжите вкруговую. Прикрепите 2 маркера: в начало ряда (=бок) и через 84 п. (второй бок). Провяжите 6 р. лицевой гладью.
2. В след.р. выполните ряды по схеме (1-6 р.). В 7-м р. сделайте 2 убавления до и после маркеров (см.выше) (=164п.). Повторите убавки еще в 9, 17 и 19 р. Всего в вертикальном раппорте убавили 16 п. Сделайте еще 2 такие же убавки (168 – 3 × 16 = 120п.). Далее убавления повторите только в 7 и 9 р. (=112п.)
3. Затем провяжите 1 р. светло серым цветом и 1 р. голубым и закройте все петли.
4. Обвяжите с двух сторон голубой ниткой с помощью крючка столбиками без накида, вводя крючок в светло серый ряд.

Легкая модель для начинающих

Какой вариант выбрать тем, кто только начинает учиться мастерству – хомут платочной вязкой из крупной пряжи. Для начинающих это отличный выбор. Выглядеть аксессуар будет стильно, а связать такую вещь просто и быстро. Изготовить хомут платочной вязкой возможно двумя способами: в поперечном направлении (модель справа) или по кругу круговыми спицами (слева). Рассмотрим оба способа.

Хомут платочной вязкой на прямых спицах для начинающих

Для примера возьмем стильную модель от RedHeart. Вам понадобится 300-400 гр крупной пряжи и спицы №15.
Размер: 36 на 89 см.
Описание вязания хомута на шею для начинающих:
Наберите 21 п. и вяжите платочной вязкой (все п. лицевые) в прямом направлении рядами “туда – сюда” до тех пор, пока длина не станет 89 см. Свободно закройте все петли и сшейте начальный и завершающий ряды.

Примечание: вы можете связать и более широкий хомут на голову, если наберете большее количество петель (=30/40).

Хомут платочной вязкой по кругу

Чтобы связать хомут на шею и на голову воспользуйтесь простым способом: возьмите толстую пряжу и сделайте образец.
Допустим, в 10 см у вас 12 п. Тогда для обьема хомута 60 см вам необходимо набрать 72 п.
Платочная вязка прямыми и круговыми спицами вяжется по-разному. На прямых работа выполняется только лицевыми п. При использовании круговых спиц необходимо вязать 1 р. лицевыми п., 1 р. изнаночными. Чтобы не запутаться, где начинается ряд, ставьте в начало р. маркер.
Чередуя лицев. и изнан. р. вяжите изделие на ту высоту, которая вам нравится.

Используем остатки пряжи

Еще один простой узор для хомута на спицах – путанка. Для вязания вы можете использовать остатки разных цветов, которых у каждой вязальщицы собирается огромное количество. Этот узор еще называют рис и жемчужный.
Размеры: 44 на 78 см.
Понадобится:
– по 50 гр пряжи с характеристиками 100мет/50гр зеленого, оливкового, киви, коричневого и серого цветов;
– спицы на леске №5

Узор путанка:
1р.: 1лиц., 1изн.;
2р.: над лиц.п. вяжите изнаночную, над изнаночной – лицевую.
Чередование полосок: по 2 р.: * зеленого, оливкового, киви, коричневого, серого цвета *.
Плотность: 14 п. = 10 см.

Схема вязания:
Зеленым цветом наберите 110 п., замкните в кольцо и вяжите узором путанка, чередуя полоски согласно описанию. После того, как выполните 114 р. (=44см), закройте свободно все петли.

С шишечками и листиками

Следующая вязка для хомута с узором из шишечек и листиков. Шикарная модель, которая сразу обратит на себя внимание. А всего-то работа займет времени пара вечеров.
Размеры: 38 на 94 см.
Расчет предоставлен для пряжи с параметрами 80мет/50гр (например, Lana Grissa Bingo Melange) и спиц №4,5. Расход 450 гр.
Плотность: 19,5 п. = 10 см.

Узор листья вяжите по схеме В ( на рис.А – длинный выделенный прямоугольник). По изнанке петли и накиды вяжите изнаночн.п. Начните с одной п. и в 1-м р. с помощью накидов добавьте 2 п. (=3п.). Повторите то же самое в третьем и пятом р. (=7п.). С девятого р. убавляйте по схеме с каждой стороны по 1 п. до тех пор, пока не останется 1 п.

Узор шишечки: вяжите по схеме А. Начните петлями перед стрелочкой, затем постоянно повторите петли раппорта, закончите кромочной. В высоту повторяйте сначала с 1-го по 46-й р., далее с 3-го по 46 р.

Схема вязания хомута на голову спицами
Наберите 152 п. и свяжите 2,5 см (=6р.) платочным узором (все п. лицев.) и 2 р. лицев.гладью (лицев.р. – лицев.п.; изнан.р. – изнаночные). Одновременно в первом лиц.р. после третьей петли и 29 раз после пятой п. прибавьте по одной перекрещенной петле (=182 п.) Далее продолжайте основным узором шишечками и листьями (=6 раппортов). После того, как свяжете 90 р. (=33см) от начала вязания узора, закончите двумя р. лицев.гладью и шестью р. платочным узором. В первом р. лицев.глади уменьшите 30 п. в том же ритме, как в начале (=152п.). Сшивайте хомут по коротким сторонам.

Из буклированной пряжи

Чтобы получился этот красивый женский хомут, необходима буклированная пряжа, а узор используется самый простой – изнаночная гладь.
Габариты: 60 на 80 см.
Материалы:
– пряжа Pela (69% полиакрил, 17% шерсть, 14% полиамид, 105мет/150гр) – 2 мотка;
– круговые спицы №10.
Плотность: 6.5 п. = 10 см.
Описание работы: наберите 52 п., объедините в кольцо и выполняйте изнаночную гладь (все п. изнаночные). После того, как свяжете 60 см от начала, закройте петли.

Элиза Landre
Следующий узор для вязания шарфа хомута называется Landre Eliza. Этой вязкой вяжутся шапки, шарфы и хомуты. На сайте TatuchkaClub.ru уже была статья с подробным изложением вязания. Переходите по ссылке под фото.

Схема и описание вязания

Косыми петлями

Чтобы связать цветной шарф хомут своими руками, возьмите 1 моток пряжи Opal Flower Power (75% шерсть, 25% полиамид, 425мет/100гр) меланжевого цвета в нужной вам гамме и спицы №3.
Как связать хомут:
Наберите 132 п. и вяжите 150 р. по схеме прямыми и обратными рядами, затем свободно закройте петли. Выполните шов.

Шарф-хомут Celeste

Очередная модель в подборке – вязаный спицами хомут на шею или голову под названием Celeste.
Окружность 68 см, в высоту 46 см.
Потребуется:
– пряжа с характеристиками 50мет/50гр – 350 гр;
– круговые спицы 9.
Плотность: 10 п. = 10 см.

Основной узор:
1р.: * 2лиц., 2изн. *;
2р.: над лицев. – лицевые, над изнан. – изнаночные;
3р.: над изнан. – лицевые, над лицев. – изнаноч.;
4р.: как второй.

Описание вязания хомута для женщин:
Не затягивая, наберите 68 п. нитью в два сложения. Отрежьте одну нитку и продолжайте по схеме узора пряжей в одно сложение вкруговую. Когда высота изделия достигнет 45 см, закройте все петли в две нити.

С оригинальной двухцветной косой

Моделей хомутов с косами достаточно много. Отличие следующего варианта в подборке в оригинальной косе из двух цветов.

Габариты: 23 на 152 см.
Понадобится:
– пряжа Bernat Roving (80% акрила, 20% шерсти, 109мет/100гр) – по 100 гр обоих цветов;
– спицы 6,5.
Плотность: 12 п. = 10 см.

Условные обозначения:
Н1 – нить первого цвета;
Н2 – нить второго цвета.

Как вязать хомут:
Наберите нитью Н1 18 п. и нитью Н2 18 п. (=36п.).
1р.(ЛС): Н1 – * 1лиц., 1изн. * – 5 раз, 1 изн., 7лиц., Н2 – 7лиц., 1 изн., * 1 изн., 1лиц. * – 5 р.;
2 и 4 р.: по рисунку;
3р.: Н1 – * 1изн., 1лиц. * – 5 р., 1изн., 7лиц., Н2 – 7лиц., 1изн., * 1лиц., 1изн. * – 5 р.;
5р.: Н1 – * 1лиц., 1изн. * – 5 р., 1изн., снимите 7 п. на вспом.сп. перед работой, Н2 – 7лиц. с левой сп., Н1 – 7лиц.
со вспом.сп., Н1 – 1изн., * 1изн., 1лиц. * – 5 р.;
6р.: Н2 – * 1изн., 1лиц. * – 5 р., 1лиц., Н1 – 7изн., Н2 – 7изн., Н1 – 1лиц., * 1лиц., 1 изн. * – 5 р.;
7р.: Н1 – * 1изн., 1лиц. * – 5 р., 1 изн., Н2 – 7лиц., Н1 – 7лиц., Н2 – 1 изн., * 1 изн., 1лиц. * – 5 р.;
8р.: как шестой р.;
9р.: как седьмой р.;
10-21р.: повторить с шестого по девятый р. 3 раза;
22р.: как шестой р.;
23р.: Н1 – * 1 изн., 1лиц. * – 5 р., 1 изн., снимите 7 п. на вспом. сп. за работой, 7лиц. с левой сп., Н2 – 7лиц. со
вспом.сп., 1 изн., * 1лиц., 1 изн. * – 5 р.;
24р.: как четвертый р.;
25-36р.: повторить с первого по четвертый р. 3 раза.
Вяжите с 1-го по 36-й р. до тех пор, пока высота хомута не будет 152 см, закончив 36-м р. Сшейте первый и последний ряды.

Как связать шарф хомут спицами и крючком

С наступлением холодов всем нам хочется одеться потеплее и при этом модно. Незаменимым аксессуаром в гардеробе в это время года являются шарфы. Ассортимент их велик, но неизменной любовью и популярностью пользуется шарф-хомут. Уже который год подряд этот шарф с удовольствием носят и женщины, и мужчины, и дети.

История появления

Изначальное название шарфа в виде трубы – снуд (от «snood»), что буквально означает «поводок». Такой головной убор появился еще в средневековье, пользовался успехом в 19 веке в Америке и Шотландии, во время Второй Мировой Войны его носили женщины Британии. За свою историю существования снуд имел разный вид, от ленточки и сетки для волос до куска ткани в виде платка.

Но как известно, мода делает свои витки в истории и возвращается в обновленном виде. В настоящее время с появлением трикотажа снуд обрел новую жизнь.

Описание и разновидности

Снуд – это шарф, концы которого сомкнуты в кольцо. Он может плотно прилегать к горлу (иметь вид воротника толстого свитера), один или два раза обвиваться вокруг шеи, иметь застежку на пуговицы или кнопки.

В продаже имеется большой выбор модных шарфов. Но не всегда нас устраивает качество, цвет, да и оригинальности хочется. А почему бы не попробовать связать неповторимую модель шарфа-хомута своими руками. Для начала надо определиться с выбором и рассмотреть варианты исполнения.

Длина

• Вариант более прилегающий к горлу подразумевает небольшую длину шарфов: по обхвату шеи или чуть больше. Они хорошо защищают от ветра и удобны для детей.
• Длинный вариант исполнения достигает до 2 м и может обвивать шею два или даже три раза. Длинный шарф-снуд позволяет второй оборот одеть на голову и согреть одновременно плечи.

Ширина

• Выбор ширины зависит от фактуры ниток и назначения. Если вы хотите иметь теплый шарф, то лучше подойдет ширина от 35 до 50 см.
• Узкий по ширине шарф — от 20 до 35 см лучше делать из тонких ниток для нескольких оборотов.

Нитки, фактура и цвет

• В магазинах рукоделия сейчас представлен большой выбор ниток, остается только выбрать желаемый цвет и фактуру материала. Это может быть хлопок, лён, шерсть, кашемир, альпака, мохер…. Нитки можно комбинировать, использовать, например, шерсть и мохер. Для большего комфорта подойдет состав ниток, где 50% шерсти и 50% другого материала.
• Пряжа может быть нейтрального или яркого цвета. Главное, что бы он сочетался с вашими базовыми вещами гардероба. Так как шарф — это аксессуар, то с выбором цвета можно быть смелее.
• Шарф-снуд, связанный из тонких ниток (хлопок, лён, шелк) можно носить даже летом. Он создаст интересный образ в общем комплекте одежды.

Способы вязания

• Вязать шарф-снуд можно на 2-х спицах, тогда в конце вязки короткие концы надо будет сшить иголкой или крючком.
• Можно использовать круговые спицы, что исключает шов на изделии.
• Крючком также существует много вариантов исполнения.
• Рисунок при вязании может быть как самый простой, так и сложный: фактурный, ажурный, с орнаментом или цветовыми переходами, с махровым эффектом (вытянутые петли), в виде сетки.

Украшение

• Готовый шарф можно украсить по краю вышивкой, бусина, мехом, кистями.

Модели и описание

Шарф-снуд, узор-«платочная вязка»

• Для того, что бы ваш первый шарф-снуд получился наверняка, то лучше начать с простой платочной вязки, выбрать толстые и мягкие нитки, предусмотреть длину 140-160 см (для двойного оборота), высоту 25-30 см. Такой шарф получится более объемным, пластичным и эффектным изделием. Лицевая и изнаночная стороны будут выглядеть одинаково, что важно для шарфа.
• Для модели понадобится: прямые спицы N5-8, пряжа– 250-300 г.
• На спицы набрать 30-50 петель, вязать платочной вязкой пока не будет достигнута нужная длина.
• В конце вязки закрыть все петли.
• Края аккуратно сшить иголкой или крючком.

Платочная вязка:

• Все ряды вяжутся лицевыми.

На заметку: если все петли провязать за заднюю стенку, то вязка будет более плотной и изделие не будет деформироваться.

Шарф-снуд, узор-«резинка»

Аналогично вяжется шарф-снуд резинкой. Многочисленные виды резинки придают законченность трикотажному изделию. Удачным выбором будет английская или граненая резинка. Направление вязания может быть как вдоль, так и поперек. При вязании вдоль (от короткого края) следовать надо той же последовательности, что и для описания вязания шарфа-снуда платочной вязкой.

Для вязания поперек (вверх от длинного края):

• На спицы набрать 240-280 петель, провязать первые и последние 2-а ряда обычной резинкой 1х1, а все промежуточные ряды – английской резинкой, пока не будет достигнута нужная высота.
• Закрыть последний ряд.
• Края аккуратно сшить иголкой или крючком.

Английская резинка:

1. При наборе количество петель должно быть четным.
2. 1-й ряд: *1 лицевая, 1 петлю снять изнаночной с накидом– нить переведите между спицами перед работой и накиньте на левую спицу, затем снимите этот накид и петлю не провязывая изнаночной на правую спицу (снятая петля покрыта своеобразным накидом).*
3. 2-й ряд: *провяжите из предыдущего ряда снятую петлю с накидом вместе лицевой. Снимите следующую петлю изнаночной с накидом.*
4. Далее: вяжите по описанию второго ряда.

Примечание: звездочки обозначают раппорт (повтор) узора.

Гранёная резинка:

1. Наберите число петель, кратное 3.
2. 1-й ряд:*2 лицевые, 1 петлю снять изнаночной.*
3. 2-й ряд: все петли изнаночные.

Особенности этой вязки: можно варьировать узор, увеличивая число лицевых петель между снятыми петлями или оставлять две снятые петли между лицевыми петлями.

По краю гранёной резинки хорошо будет смотреться жгут или коса.

Шарф-снуд, узор – «рис»

Узор «рис» очень прост в исполнении, обеспечит одинаковый вид на обеих сторонах изделия, а полотно не будет скручиваться.

«Рис»:

1. Свяжите образец для расчета петель.
2. Для одного оборота окружность шарфа должна быть около 80 см, для двух оборотов – в 2-а раза больше.
3. Наберите четное число петель.
4. 1-й ряд: * 1 лицевая, 1 изнаночная*.
5. 2-й ряд и все остальные:* 1 лицевая, 1 изнаночная*.

Над лицевыми вяжутся изнаночные петли, а над изнаночными – лицевые.

Шарф-снуд, ажурная вязка

Для более романтичного образа, из светлых и нежных тонов можно связать шарф ажурным узором. Это более сложная техника и требует большего внимания и времени. Но результат того стоит. Такое изделие смотрится дорого и изыскано. Его можно одеть как с верхней одеждой, так и с платьем.

Английский ажур (в виде сетки):

1. Свяжите образец для расчета петель.
2. Один оборот в 70-80 см будет подходящим вариантом для ажурного шарфа-снуда, а вот по высоте можно сделать его чуть больше – 40-50 см, для красивой драпировки.
3. Наберите четное число петель.
4. Все нечетные ряды: все петли изнаночные.
5. Все четные ряды: *накид, 1 петлю снять лицевой, 1 лицевая, закройте снятую петлю над только что провязанной петлей.*

Шарф-снуд двухцветный

Для такого шарфа подберите нитки разных цветов, гармонично сочетающиеся между собой. Половину изделия можно связать одним цветом, половину – другим или равномерно чередовать полосами. Рисунок вязки – любой на ваш вкус. Особенно хорошо смотрится модель из хлопковых, вискозных или льняных ниток.

Шарф-снуд с орнаментом

Вариант шарфа с орнаментом требует мастерства. Для него понадобятся нитки нескольких цветов. Фрагменты можно расположить как по всему полотну, так и отдельными элементами. Лучше найти в журнале или интернете подходящую схему и строго следовать ей. Предварительный расчет петель по высоте и ширине должен быть более тщательным, так как рисунок орнамента должен совпадать точно.

Мир моды предлагает много идей для вязания шарфа-снуда, с применением различных техник и уровня мастерства. Это уютное и красивое изделие будет хорошим подарком для родных и друзей. Попробуйте придумать и создать свою неповторимую модель. У вас обязательно получится!

Фото идеи самодельных вязаных хомутов

Шарф хомут спицами схемы и описание

Уже который сезон шарфик-хомут полюбился многим благодаря своему крою замкнутого кольца, что позволяет создать с его помощью огромное количество модных look’ов. Вы можете просто накинуть его на шею или замысловато завернуть, закрыть или раскрыть плечи… Наш сегодняшний мастер класс как раз и будет посвящен тому, как связать своими руками шарф хомут спицами схемы и описание позволят связать аксессуар даже мастерице-новичку!

Воздушный снуд «Нежность»

Этот элегантный, нежный и легкий шарфик как никогда идеален на осень – он защитит от прохладного ветерка и подчеркнет хороший вкус своей обладательницы. Наша подробная схема и описание к ней делают этот шарфик доступным даже для начинающих вязальщиц!

Нам понадобится:

• пряжа (99% акрил, 1% металлик, 190 м на 113 гр.) – 2 моточка;
• круговые спицы № 5, длина – 60 см;
• маркер.

Плотность вязания составит 16 п. х 21 р. = 10 х 10 см.

Размер готового шарфа – 147,5 см в длину и 25,5 см в ширину.

Описание

Набираем круговыми сп. 231 петельку, ставим маркер и соединяем в круг. Очень важно – проследите, чтобы все петельки лежали ровно. Не перекрещиваясь! Далее вяжем по кругу согласно схемы.

Платочная вязка
1 р.: и. п..
2 р.: л. п..
3 р.: и. п..

Ажурный узор
1 р.: *1 л. п., накидок, 2 п. вм. л., повторяем от *.
2 р.: л. п..
3-6 рр.: как 1-2 рр.
7 р.: *1 л. п., снимаем п. как лицевую, 1 л. п., нак. снятую п. на провязанную, делаем накидок, повторяем от * до конца ряда.
8 р.: л. п..
9-10 рр.: как 7-8 рр..
11 р.: как 7 р..

Платочкая вязка (второй вариант)
1 р.: л. п..
2 р.: и. п..
34 рр.: как 1-2 рр..
5 р.: л. п..

Центральный рисунок
1-2 рр.: л. п..
3 р.: *1 л. п., 2 п. вм. л., накидок, 1 л. п., накид, снимаем п. как лицевую, нак. снятую п. на провязанную, 1 л. п., повторяем от * до конца ряда.
4 р.: л. п..
5 р.: *2 п. вм. л., накид, 3 л. п., накид, снимаем п. как лицевую. 1 л. п. нак. снятую п. на провязанную, повторяем от * снова и снова.
6-21 рр. = 1-5 рр. х 4 раза.
22-23 рр.: л. п..
Обрезаем нить, затягиваем ее, и наш эксклюзивный аксессуар своими руками готов!

Шарф снуд с косами: видео мастер-класс

Ажурный снуд «Коралловая мечта» от Нэнси Томас

Этот дизайнерский шарфик подойдет практически любой девушке. Легкий и кружевной, он гармонично дополнит романтический образ скрасит даже самый пасмурный день!

Нам понадобится:

• пряжа (100% акрил, 211 м на 141 гр.) – 1 моточек;
• круговые спицы № 6, длина – 60 см;
• маркер.

Плотность составит 14 п. х 22 р. = 10 х 10 см.

Готовый шарф будет 150 см в длину и 25,5 см в ширину.

Техники вязания

2 петли вместе лицевой влево: вводим правую сп. в первую и вторую п. левой сп. и провязываем их лицевой, не перекручивая при этом п.;

2 петли вместе лицевой вправо: вводим правую сп. во вторую, потом – в первую п. левой сп., провязываем их вместе лицевой за переднюю стенку.

Описание

Набираем круговыми спицами 210 петелек, ставим маркер (убедитесь, что петли при этом не перекручены!) и вяжем по кругу платочным узором:
1 р.: и. п..
2 р.: л. п..
3 р.: и. п..

Теперь приступаем к «зигзагу»:
1 р.: *1 л. п., накид, 2 п. вм. л. впр., повтор. от *.
2 р.: л. п..
3-6 рр.: 1-2 рр. х 2.
7 р.: *1 л. п., 2 вм. л. вл., накид, от * до конца рядочка.
8 р.: л. п..
9-10 рр.: повтор. 7-8 рр..
11 р.: как 7 р..

Теперь снова беремся за платочную вязку:
1 р.: л. п..
2 р.: и. п..
3-4 рр.: как 1-2 рр..
5 р.: л. п..

Сейчас мы вывязываем ажурный рисунок:
1-2 рр.: л. п..
3 р.: *1 л. п., 2 п. вм. л. впр., накид, 1 л. п., накид, 2 п. вм. л. вл., 1 л. п., от * до конца рядочка.
4 р.: л. п..
5 р.: *2 п. вм. л. впр., накид, 3 л. п., накид, 2 п. вм. л. вл., от *.
6-17 рр.: повтор. 2-5 рр. х 3 раза.
18-19 рр.: л. п..

Снова платочный узор:
1 р.: л. п..
2 р.: и. п..
3-4 рр.: как 1-2 рр..
5 р.: л. п..

«Зигзаг»:
1 р.: *1 л. п., нак., 2 п. вм. л. впр., от *.
2 р.: л. п..
3-6 рр.: 1-2 рр. х 2.
7 р.: *1 л. п., 2 п. вм. л. вл., нак., от *.
8 р.: л. п..
9-10 рр.: как 7-8 рр..
11 р.: как 7 р..

В завершение – снова платочный узор:
1 р.: и. п..
2 р.: л. п..
3 р.: и. п..
Осталось только закрыть петельки, закрепить нить и легкий ажурный снуд для начинающих готов!

Шарф хомут – модный тренд

Объемный снуд воротник от Vogue Knitting

Этот теплый зимний шарф прекрасно подойдет на холодное время года и бережно согреет Вас в мороз! Изделие может быть использовано также как шапка-капюшон, что делает такую вещь незаменимой в базовом женском зимнем гардеробе. Нижеизложенная инструкция поможет Вам связать шарф хомут круговыми сп., даже если опыта работы с этим инструментом пока совсем немного.

Нам понадобится:

• пряжа (43% альпака, 23% лен, 19% шерсть, 15% полиамид, 80 м на 50 гр.) – 5 моточков;
• круговые спицы № 5 и № 5,5, длина – 74 см;
• дополнительная сп. для кос;
• маркеры.

Плотность вязания составит 18 п. х 21 р. = 10 х 10 см сп. № 5 резинкой или 17 п. х 21 р. = 10 х 10 см сп. № 5,5 (узоры согласно схемы).

Техники вязания

Резинка: *1 л. п. за заднюю стенку, 1 и. п., от * по кругу.

Коса 4 х 4 вправо (влево): снимаем 4 п. на доп. сп. для кос, оставляем их за (перед) работой, далее 4 л. п. с лев. сп., 4 л. п. с доп. сп..

Описание

Круговыми сп. № 5 набираем 152 п., ставим марке, соединяем в круг, затем – резинка 9 р., заменяем сп. на № 5,5 и работаем согласно схемы: повт. 38 п. раппорта схемы в ширину х 4, затем нам нужно повт. 1-20 рр. схемы х 3 р., снова переходим на сп. № 5 и снова резинка х 9 р., закрываем все петельки, обрезаем и затягиваем нить. Эксклюзивный снуд своими руками готов к выходу в свет!

Модный шарф хомут связанный на руках: видео мастер-класс

https://youtu.be/WcQUmZeNcHM

Яркий осенний снуд спицами

Мягкий, теплый и объемный, этот аксессуар подойдет и под осеннее пальто, и под спортивную курточку, а простая схема вязания делает процесс простым и доступным для начинающих мастериц.

Нам понадобится:

• пряжа (70% акрил, 30% шерсть, 110 м на 100 гр.) – 3 моточка;
• сп. № 8;
• трикотажная игла.

Плотность шарфа составит 13 п. х 16 р. = 10 х 10 см.

Размер готового изделия – 160 см в длину, 40 см в ширину.

Техники вязания

Перекрещение 2-х петелек вправо: пропускаем первую п. левой сп., провязываем вторую п. лиц., потом пров. первую п. лиц, снимаем 2 п. с левой сп..

Перекрещение 2-х петелек влево: пропускаем первую п. левой сп., провязываем вторую п. лиц. за заднюю стенку, пров. первую п. лиц., снимаем две п. с левой сп..

Описание

Набираем 56 п., работаем по схеме.
1 р. (изнаночная сторона): 1 и. п., *2 л. п., 2 и. п., от * до последних 3 п, 2 л. п., 1 и. п..
2 р.: *1 л. п., 1 и. п.. перекр. 2 п. впр.. перекр. 2 п. вл., 1 и. п., 1 л. п., от * до конца ряда.
3 р.: *1 и. п., 1 л. п.. 1 и. п., 2 л. п., 1 и. п., 1 л. п., 1 и. п., от *.
4 р.: *1 л. п., перекр. 2 п. впр., 2 и. п., перекр. 2 п. вл., 1 л. п., от *.
5 р.: 2 и. п., *4 л. п., 4 и. п., от * до последних 6 п, 4 л. п., 2 и. п..
6 р.: л. п..
7 р.: как 1 р..
8 р.: *перекрец. 2 п. вл., 1 и. п., 2 л. п., 1 и. п., перекрещ. 2 п. впр., от *.
9 р.: *1 л. п., 1 и. п., 1 л. п., 2 и. п., 1 л. п., 1 и. п., 1 л. п., от *.
10 р.: *1 и. п., перекрещ. 2 п. вл., 2 л. п., перекрещ. 2 п. впр., 1 и. п., от *.
11 р.: 2 л. п., *4 и.п., 4 л. п., от * до последн. 6 п., 4 и. п., 2 л. п..
12 р.: л. п..

Повторяем 1-12 рр. до достижения высоты полотна ав 160 см, заканчиваем 12 р. и закрываем все п.. Нам осталось только затянуть нить, аккуратно спрятать концы и сшить две части шарфа. Осенний аксессуар готов!

Шарф снуд с косами: видео мастер-класс

Демисезонный снуд с декоративными пуговицами

Снуд с пуговками идеален для стиля «кэжуал» – он идеален как под кофту, так и под курточку. Довольно необычные узоры делают его поистине эксклюзивным, а теплая пряжа – практичным, ведь такой модный аксессуар подойдет не только на межсезонье, но и на теплую зиму!

Нам понадобится:

• пряжа (65% шерсть, 35% хлопок, 55 м на 100 гр.) – 6 моточков;
• круговые сп. № 6,5, длина – 60 см;
• маркер
• трикотажная игла;
• три пуговицы диаметром 2,5 см.

Плотность составит 14 п. х 20 р. = 10 х 10 см ажурным рисунком или 12 п. х 20 р = 10 х 10 см лицевой гладью.

Изделие будет 65 см в длину и 20,5 см в ширину.

Техники вязания

Протяжка: снимаем п., 1 л. п., накидываем снятую п. на провязанную.

Двойная убавка: пр. сп. продеваем первые 2 п. слева направо, снимаем на пр. сп., 1 л. п., накидываем 2 снятые п. на провязанную.

Главный рисунок на 5 п.:
1 р.: 1 и. п., 3 л. п., 1 и. п..
2-3 рр.: 5 и. п..
4 р.: 1 и. п., 3 л. п., 1 и. п..
Повторяем 1-4 рр..

Ажурный рисунок на 8 + 9 п.:
1-2 рр.: 1 л. п., *нак., 1 л. п., 2 п. вм. л., 1 л. п., протяжка, 1 л. п., нак., 1 л. п., от *.
3 р.: 1 л. п., *1 л. п., 2 п. вм. л., нак., 1 л. п., нак., протяжка, 2 л. п., от *.
4 р.: 1 л. п., *1 л. п., 2 п. вм. л., накидок, 3 л. п., накидываем, протяжка, 1 л. п., от *.
5 р.: 2 п. вм. л., *накидываем, 5 л. п., накидываем, двойная убавка, от * до последн. 7 п., накидываем, 5 л. п., накидываем, протяжка.
Повторяем 1-5 рр..

Описание

Набираем 86 п., ставим маркер, соединяем в круг, 1 р. л. п., сл. р. – поворот: *накидываем, 2 п. вм. л., от *.
1-2 рр.: л. п..
3-6 рр.: 1 и. п., 3 л. п., 2 и. п., 3 л. п., (2 и. п., 2 л. п., 1 и. п., 2 л. п., 1 и. п.) х 9, 1 и. п., 3 л. п., 1 и. п..
7 р.: 1 и. п., 3 л. п., 1 и. п., далее – л. п..

Теперь узоры:
1-20 рр: 5 п. главным уз., остальные – ажурным, провязываем главный рисунок 5 раз по вертикали, ажурный – 4 раза.
21-24 рр: как 1-4.

Приступаем к убавкам: 1 и. п., 3 л. п., 1 и. п., 2 п. вм. л., 2 л. п., *3 л. п., двойная убавка, 2 л. п., от * до последн. 5 п., 3 л. п., прот. = 66 п..

Снуд почти готов, заканчиваем работу:
1-4 рр.: 1 и. п., 3 л. п., 2 и. п., 2 л. п., (2 и. п., 3 л. п., 1 и. п.) х 9, 1 и. п., 2 л. п., 1 и. п..
5-6 рр.: л. п.
7 р.: поворот – *накидываем, 2 п. вм. л., от *.
8 р.: л. п., закрываем п., сшиваем шарф и пришиваем декоративные пуговицы.

Снуд Омбре: видео мастер-класс

Как видите, связать шарф хомут спицами не сложно. Будем рады, если наш мастер класс окажется Вам полезным!

Вязание хомута спицами: схема с описанием

Шарфы-хомуты или, как это сейчас модно называется, снуды, представляют собой вещи очень теплые, универсальные и довольно удобные. Их можно носить в любое время года, когда прохладно. Это относится и к поздней осени, и к ранней весне, и к холодной зиме. Как же происходит вязание хомута, узнаем из статьи.

Вяжем и носим

Несомненно, совершенно не обязательно вязать такой шарф самостоятельно. Можно просто приобрести его в магазине, где вниманию покупателей предоставлены модели разных расцветок и фасонов.

И все же некоторым женщинам хочется хоть иногда побыть домашней рукодельницей, чтобы вязание хомута спицами принесло не только новую вещь в гардероб, но и удовольствие от того, что аксессуар связан своими руками. Действительно, такой поступок весьма правильный, ведь творя самостоятельно, есть возможность удовлетворить свой вкус и даже самовыразиться.

Носим правильно

Вязание хомутов шарфов-снудов осуществляется тремя способами:

1. Полоской, сшиваемой в самом конце работы.

2. Полоской обычной, в которой части соединены пуговицами.

3. Бесшовный хомут — при его вязке используются круговые спицы.

Итак, вязание шарфа-хомута позади. Теперь остается один вопрос: как правильно его носить. Такой модный современный аксессуар следует сочетать с цветом сумки или обуви. С ним можно носить почти все вещи: и юбки различного фасона, и привычные джинсы, и даже классические брюки. Со всеми вещами хомуты будут выглядеть весьма гармонично.

Хомуты можно украшать бисером, брошами, пайетками. А потенциальным покупателям остается всего лишь выбирать то, что им по душе.

Важные отличия

При первом взгляде на такие шарфы кажется, что они выглядят совершенно одинаково, ничем, собственно, не отличаясь. Но так ли это на самом деле? Самым важным отличительным признаком является размер. Есть шарфы, которые принято носить на пару оборотов. Первый оборот набрасывается на голову, а вот второй — на шею. Существует и вариант, при котором предусмотрено ношение всего лишь в один обхват, если размер шарфа не дает возможности сделать по-другому.

Но и в однооборотных вариантах есть свои различия. Вязальщица вяжет свое изделие как простой прямой шарфик, а после окончания работы сшивает его трикотажным швом в кольцо. Если же шов не приветствуется, тогда надо вязать шарф-хомут вкруговую. При использовании первого способа можно выбрать как короткую, так и длинную сторону шарфика.

Да и нити, которыми предполагается вязать такой шарф, бывают разного состава. Можно выбирать толстую и мягкую пряжу, из которой получится рельефный узор с косами. Если взять мохер, из него получится паутинка. Для некоторых моделей выбирают жаккардовую технику по кругу. В этом случае хомут получается без изнаночных полосок.

Вяжем для мужчин

Вязание хомута, предназначенного для представителей сильной половины человечества, сейчас является достаточно модным занятием. На парнях такие изделия выглядят очень эффектно благодаря лаконичной расцветке и простым узорам.

Те, кто относят себя к минималистам, предпочитают именно эти шарфы за простоту и легкость использования. Те, кто считают себя современными мужчинами, ни за что не откажутся от такого аксессуара. Ведь это в некотором смысле престижная вещь, позволяющая заметить, что ее владелец идет в ногу со временем.

Разберемся, как должно осуществляться вязание спицами снуда (хомут-шарфа), который в последнее время так популярен как у молодежи, так и среди населения зрелого возраста.

Этапы работы

Как правильно вяжется шарф-хомут для мужчин при использовании любого узора? Нам для работы понадобятся спицы номер шесть и семь, пряжи нужно иметь около 300 г. На спицы № 6 (круговые) набирается 180 петель, в конце ряда обязательно надо поставить маркер. Теперь вязание можно соединить и вязать по кругу. На таких спицах надо вязать шесть рядов, постоянно чередуя: ряд изнаночных петель, ряд — лицевых. Получается платочная вязка.

Один ряд провяжите лицевыми петельками. Следом в работу вступают спицы № 7. На них провязывается один ряд. Теперь шарф можно вязать по любой выбранной схеме до той высоты, которая необходима. Четные ряды следует вязать строго по рисунку.

Далее один ряд провяжите лицевыми петлями, используя спицы № 7. Поменять на спицы № 6 и провяжите рядок лицевыми петельками. Шесть рядочков, которые идут потом, вязать нужно, делая по очереди, — ряд лицевыми и рядок изнаночными петлями (это платочная вязка). Теперь нужно закрыть петли. Шарф готов.

Для милых дам…

Вязание хомута для девушек и женщин предполагает практически бесконечный выбор разнообразных узоров и, собственно, вариантов вязания. Вот один из них. Для работы мастерице понадобятся 50 г пряжи и круговые спицы № 5 (их длина должна быть сто сантиметров).

На спицы набирается 241 петля, все заключается в круг, и далее вяжется по схеме:

• первый ряд — только лицевые петельки;
• второй ряд — провязывание двух петелек вместе с лицевой (правая петля должна идти поверх левой), сделайте накид*, повторяйте точно так же от * до * до последней петли, одна лицевая;
• третий ряд — все петли вяжутся изнаночными;
• четвертый ряд — делаем одну лицевую, накид, снимите непровязанной одну петлю, одна лицевая, накиньте на провязанную петлю снятую*, повторяйте от * до * до окончания петель на спице.

Вся остальная работа заключается в провязывании рядочков до той ширины, которая необходима мастерице.

Начинающим вязальщицам

Далеко не все дамы, берущие в руки спицы, являются мастерицами со значительным стажем. Но и им захочется приобщиться к современной моде, украсив себя модным нынче аксессуаром. Вязание хомута, описание которого будет дано чуть ниже, займет буквально несколько дней, да и работа не будет сложной.

Вяжется такой хомутик вязкой платочной потому, что узор простой, да и пластичность повышена. Верхняя часть трубы будет плотно прилегать к шее модницы, а на ее плечах будет веерообразно лежать остальная часть.

После того как выполнен набор петель, можно приступать к вязанию первого ряда. По отдельности отмечаются кромочные петельки. Их следует вязать очень аккуратно, чтобы потом, в конце работы, не отделывать края у снуда. Когда полоса платочной вязкой уже выполнена, необходимо оставить последнюю петельку и вывязать ее изнанкой.

Теперь изделие необходимо повернуть и снять на правую спицу первую петлю, не провязывая. Продолжайте работу. Последнюю петлю вывязывайте так же — изнаночной. После того как изделие довязано до необходимой длины (каждый здесь может выбрать для себя то, что нужно) надо закрыть петли так: следующую петлю протяните через ту, которая находится на спице.

Этот наглядный пример показывает, что совсем несложным может быть вязание хомутов. Описание работы даст подробное разъяснение того, как и что следует делать. А в итоге получится красивый и удобный аксессуар к любой верхней одежде.

Вяжем детям

Как связать хомут спицами? Схема вязания такого шарфика для деток весьма проста. С ней может справиться начинающая вязальщица. К тому же такой шарфик будет даже полезным: если ребенок непоседа, он не сможет его снять с себя, следовательно, будет защищен от холодных ветров. А если мама свяжет такой хомут в расцветке, которую малыш любит, для него это будет большим подарком. Кстати, далеко не все детишки любят помпоны и завязки. В случае хомута эти проблемы не возникнут.

Если рассматривать снудик обхватом в 72 см и высотой — в 23, то для работы потребуются всего сто грамм пряжи, состоящей из вискозы, мериносовой шерсти и полиамида, круговые спицы № 5,5 и 6 (их длина должна составлять сорок сантиметров).

Резинка, которой будет связана часть шарфика, самая обычная — по очереди надо вязать пару лицевых и столько же изнаночных. Схема основного узора также несложная.

• Первый ряд: пять лицевых петелек, одна изнаночная; так вязать до конца.
• Второй: все то же самое, только сместить нужно на одну петлю вправо, то есть, от начала ряда будет так — четыре лицевых, изнаночная, пять лицевых, изнаночная, лицевая.

• Третий ряд: опять смещаем на одну петельку: три лицевых, изнаночная, пять лицевых, изнаночная, пара лицевых.
• Четвертый: две лицевых, одна изнаночная, пять лицевых, одна изнаночная, три лицевых.
• Пятый: лицевая, изнаночная, пять лицевых, изнаночная, четыре лицевых.
• Шестой ряд (последний): изнаночная, пять лицевых, изнаночная и пять лицевых.

В этом узоре число петелек кратно шести. Все время повторяйте с первого по шестой круг вязания. На круговые спицы номером 5,5 набирается сто петелек, замыкается в кольцо и отмечается начало кругового ряда. Дальше надо три сантиметра провязать резинкой, а в последнем ряду равномерно прибавить две петли. Всего получается сто две петли.

Переходим на круговые спицы под номером 6. Работа продолжается диагональным узором. Так нужно сделать семнадцать раппортов. После того как провязано двадцать сантиметров от начального ряда, опять перейдите на предыдущие круговые спицы и провяжите резинкой. В первом ряду равномерно нужно убавить все вязание на две петельки так, чтобы получилось 100 петелек.

Когда от начала резинки связано три сантиметра, необходимо по рисунку закрыть петельки. Теперь уже стало понятно, что вязание хомутов, шарфов, снудов не такая сложная вещь, как может показаться вначале. Зато результат обязательно впечатлит.

Вязка арматуры под фундамент — 4 способа!

Долговечность и надежность любого здания напрямую зависит от качества фундамента, на котором оно стоит. Без нормального прочного фундамента даже самые крепки стены со временем начнут рушиться. Для того, чтобы повысить прочность фундамента оптимальным решением остается – использование арматуры. В итоге правильного соединения арматурных прутьев получится прочная конструкция, которая сможет выдержать общий вес постройки. Поэтому особое внимание уделятся вязке арматуры под фундамент.

Прочное основание под фундамент также можно создать, сварив отдельные металлические стержни между собой. Однако данный способ применяется все реже.  И так как правильно вязать арматуру для фундамента. Все чаще по некоторым причинам прибегают к вязке:

1. Самостоятельное строительство и процесс варки не совместимы, так как редко кто способен полностью разобраться в нюансах и тонкостях этого дела. Проще освоить технику вязки, которая к тому же выходит еще и значительно быстрее.
2. Со временем в местах сварки начнут прогрессировать окислительные процесс, в результате протекания которых сварной шов становится менее крепким, а фундамент соответственно менее надежным. Риск возникновения коррозии, если говорить о вязке арматуры под фундамент, значительно снижается.
3. Сварка становится причиной нарушения структуры металла, что негативно скажется на конечном качестве работ. Правильно выполненная вязка станет гарантией надежности и долговечности перемычек, фундамента и прочих конструкций из железобетона.

Материалы для вязки арматуры

Перед тем, как приступить к правильной вязке арматуры для фундамента, необходимо приобрести все необходимое. В качестве арматуры используются пруты из стали определенной длины и диаметра. Прочность, долговечность и надежность фундамента напрямую зависит от толщины используемой арматуры. Запрещено использовать прутья, диаметр которых меньше 6 мм. Что касается длины, для обустройства фундамента чаще всего используется арматура длиной от 6 метров. Удобно заказывать арматурные стержни с доставкой. Это позволит вам сэкономить не только время, но и силы, которые вы благополучно в дальнейшем потратите на возведение фундамента. Обратите внимание на поверхность арматуры. Сегодня продаются как гладкие изделия, так и прутья с рифлением, гребнями и насечками. Рельефные — более удачный вариант, так как они имеют более высокую адгезию с бетоном.

Между собой стержни из металла соединяются при помощи проволоки или хомутов из пластика. От качества соединительных материалов также зависит прочность и целостность конечного результата.

Для вязки арматуры под фундамент подойдет проволока круглого сечения с диаметром 12 – 14 мм. Не стоит брать более толстую, так как ее будет сложно гнуть, а более тонкая просто не справится с нагрузками. Отличный вариант – обожженная проволока из стали, продаваемая в бухтах. Легко сгибается и принимает необходимую форму, но характеризуется высоким уровнем прочности и долговечностью. Необожженная проволока не подходит. Она тяжело гнется, часто ломается. Однако любую необожженную проволоку можно превратить в обожженную, просто подержав ее над открытым огнем и оставив остывать на воздухе на полчаса.

Проволоку необходимо поделить на равные отрезки длиной 25-30 сантиметров. Откусывать или обрезать каждый раз нужный кусок неудобно. Умудренные опытом мастера рекомендуют в несколько раз согнуть проволоку, соблюдая необходимую длину, а затем места сгиба за раз перерезать болгаркой. Так за несколько минут можно подготовить все элементы, не тратя время на постоянное обрезание.

Пластиковые хомуты, популярность которых набирает обороты, многие строители-консерваторы все-таки использовать опасаются, не доверяя данному методу крепления. Однако использование хомутов пластиковых также способно обеспечить полноценную надежную фиксацию стальной арматуры. Существует и несколько нюансов. Такой каркас часто не способен выдерживать динамические нагрузки. Если во время сборки неправильно наступить на какой-либо верхний элемент или неправильно произвести заливку бетоном, некоторые крепления из пластика могут треснуть. Особую аккуратность также необходимо проявить во время работы с вибрационным оборудованием, используемым для уплотнения бетонного слоя. Значительным преимуществом пластиковых хомутов, если сравнивать их с проволокой, является простота работы с ними. Ничего гнуть не нужно. Стоит лишь прочно затянуть хомут и соединение готово.

Необходимые для вязки инструменты

Проволоку гнуть, конечно, можно и голыми руками, однако с целью упрощения и ускорения процесса рекомендуем использовать специально предназначенные для этого инструменты. Например, крючок для вязки арматуры под фундамент, приобрести который можно в любом строительном магазине. Современный рынок представляет в широком ассортименте и самые обычные модели, и винтовые, и полуавтоматические, которые хоть и делают работу более простой, но все-таки требуют от исполнителя приложения определенной физической силы. Опытные мастера утверждают, что магазинные крючки в большинстве случаев неудобны и быстро выходят из строя, поэтому они самостоятельно изготавливают личный инструмент для работы, что позволяет не только сэкономить деньги, но и сделать процесс вязки более удобным. Чтобы своими руками сделать такой крючок, вам понадобится отрезок арматуры с рифлением и подшипник для ручки.

Отличная альтернатива всем самодельным приспособлениям и крючкам – специальный пистолет для вязки. Устройство идеально для использования при масштабном строительстве. Оно способно ускорить и значительно облегчить процесс вязки. Прибор самостоятельно скручивает проволоку с установленным усилием за 0,8 с. Такие пистолеты имеют малый вес, освобождая вторую руку, которой теперь можно придерживать крепеж. Модель пистолета, которая вам необходима, зависит от диаметра используемой арматуры. Единственным недостатком подобного рода техники можно назвать высокую цену. Растраты будут неоправданными, если пистолет приобретается для единичного строительства.

Можно создать самостоятельно в домашних условиях подобие пистолета для вязки. для этого достаточно переоборудовать шуруповерт, вставив в патрон инструмента крючок, изготовленный из проволоки с круглым сечением 4 мм. Не стоит использовать для данных целей дрель. Из-за большей скорости оборотов она не сможет справиться с поставленной задачей. Работать с самодельным инструментом следует предельно аккуратно, держа его в обеих руках.

Использование пистолета для вязки арматуры сокращает общую продолжительность работ в пять – семь раз, если сравнивать с вязкой с помощью крючка. Однако устройство не подходит для применения в труднодоступных местах, а также неэкономично расходует проволоку и нуждается в регулярном перезаряде батареи.

Схемы и способы вязки

Первое, что необходимо сделать, подготовить все необходимые материалы, отнести их к месту локации фундамента, если нужно выровнять арматурные прутья, подложить под арматуру фиксаторы из пластика, которые необходимо уложить между опалубкой и арматурой для того, чтобы отдельные части используемой арматуры не показывались из-под бетона. Можно приступать к вязке, которая может осуществляться несколькими методами.

Если для вязки арматуры использовать самозатягивающиеся хомуты из пластика, то никаких особых вопросов не возникнет. Главное, хорошо затянуть каждое соединение. Еще легче работать с пистолетом, который практически делает все сам и за мгновение. Наиболее сложным процесс станет с использованием крючка и проволоки. Именно при работе с крючком может использоваться несколько основных приемов и методов.

Сегодня известно множество вариантов вязки арматуры, отличающихся друг от друга направлением загиба проволоки. По крепости и надежности почти все методы вязки одинаковы, основным критерием выбора техники становится удобство.

Способ первый

Наиболее простой и часто используемый способ вязки арматуры для фундамерта, включает в себя такую последовательность действий:

1. отрезок проволоки складывается вдвое;
2. в месте соединения двух арматурных прутьев проволока проводится под арматуру;
3. крючок продевается в петлю проволоки;
4. пальцами необходимо подтянуть свободный конец проволоки к крючку и наложить на него, немного согнув;
5. вращательными движениями крючка скрутите оба кона проволоки;
6. сделав три – пять оборотов, убедитесь в надежности крепления и выньте крючок из петли.

Способ второй

Не слишком отличается от первого. Этапы:

1. проволока складывается вдвое и в месте соединения стержней заводится под арматуру;
2. в петлю продевается крючок;
3. через крючок перегибаем второй конец так, чтобы получилась О-образная петля;
4. вращательными движениями скручиваем полученную петлю, пока соединение не станет надежным;
5. вытаскиваем крючок.

Способ третий

Именно данный способ вязки арматуры под фундамент опытные матера называют самым удобным, так как он высвобождает одну руку:

1. проволока заводится под арматуру;
2. в петлю вставляется крючок, которым необходимо поддеть 2-ой конец проволоки;
3. по направлению вниз загибаем соединительную проволоку;
4. тянем крюк на себя и крутим несколько раз. Готово.

Способ четвертый

1. проволока вновь складывается пополам и заводится под арматуру;
2. крепко прижимая к стержню, концы ее необходимо согнуть в направлении на себя;
3. в петлю вставляем крюк, и после нескольких оборотов извлекаем его.

Такой способ дает возможность получить более прочную скрутку. Умудренные опытом профессионалы рекомендуют подгибать проволоку до начала скрутки, чтобы не приходилось раз за разом делать множество оборотов, что значительно снижает риск частого перелома проволоки. Оптимальным количеством оборотов считается три – пять.

Все способы между собой достаточно схожи, за исключением нескольких нюансов. Уже после нескольких попыток человек, который решил вязать арматуру своими руками, приловчится и сможет выбрать способ, который будет для него наиболее удобным. Бытует мнение, что легче работать с винтовым крючком, но это также, по нашему мнению, дело привычки и техники.

Заключение

Вязка арматуры хоть и не считается простым и быстрым занятием, однако, вполне доступным даже мастеру без наличия подобного опыта. Сейчас вы узнали как же правильно вязать арматуру для фундамента. Главное подобрать правильно расходные материалы и инструмент. Без сомнения, применение пластиковых хомутов или специального пистолета сделает процесс максимально быстрым и простым, но и дорогостоящим. Поэтому крючок по-прежнему остается наиболее выгодным вариантом.

Структурное понимание β-Clamp и его взаимодействия с ДНК-лигазой в Helicobacter pylori

Геном H. pylori быстро развивается и демонстрирует широкое географическое расхождение. Поскольку репликация ДНК и ее контроль играют центральную роль в размножении, патогенезе и вирулентности бактерий, мы здесь сосредоточены на β-зажиме, также известном как скользящий зажим, который является критическим компонентом механизма репликации ДНК и служит средством, способствующим процессивности. фактор репликации ДНК.Используя STAMP ¹⁸ , мы провели на основе структуры множественное выравнивание последовательностей Hpβ-Clamp с его гомологами (о структурах которых сообщалось в PDB), чтобы найти его ближайший гомолог (рисунок S1A). Кроме того, мы провели анализ в среде биоинформатического анализа Multiseq ¹⁹ , в которой мы использовали структурное выравнивание STAMP, чтобы построить филогенетическое дерево на основе структуры на основе процента идентичности (Рисунок S1B). Согласно этому дереву, Hpβ-Clamp значительно отличается от своих гомологов.

Базовая архитектура β-фиксатора

В пространственной группе C2 в каждой асимметричной единице наблюдается один мономер, который взаимодействует с другим мономером из асимметричной единицы с образованием димера. В пространственной группе P2 два мономера присутствовали на асимметричную единицу (рис. 1A). Однако не наблюдается значительных различий между этими двумя структурами из разных пространственных групп, структурное выравнивание обеих дало RMSD 0,15 Å. Хотя было обнаружено, что Hpβ-Clamp существует как в виде мономера, так и в виде димера в кристалле, согласно эксперименту по гель-фильтрации, димер был доминирующим компонентом в растворе (рис. S2).Димерная кольцевая структура представляет собой биологическую функциональную единицу, которая связывается с ДНК и скользит по ней.

Рисунок 1

Кристаллическая структура Hpβ-зажима.

( A ) Мультяшное изображение кристаллической структуры Hpβ-зажима. Цепочка A окрашена в голубой цвет, а цепь B — в красный. ( B ) Электронная карта 2Fo-Fc при 1.0σ мономера Hpβ-Clamp.

Как и ожидалось для прокариотического β-Clamp, каждая мономерная единица Hpβ-Clamp состоит из трех доменов (Рис. 1A).В Hpβ-clip домены I, II и III, как наблюдали, охватывают остатки Met1to Phe118, Pro119 до Pro 250 и Lys251 до Leu374, соответственно. Домен I состоит из девяти антипараллельных β-цепей и двух альфа-спиралей, домен II имеет восемь β-цепей и две альфа-спирали, а домен III — восемь β-цепей и две спирали. Напротив, первый домен β-Clamp E. coli (Ecβ-Clamp), как было обнаружено, содержит только восемь β-цепей ²⁰ . Наложение всех трех доменов Hpβ-Clamp (рис. S3) показало их сходные топологии и вторичные структуры, за исключением нескольких областей: среднеквадратичные отклонения (RMSD) для 118 остатков между доменами I и II, для 131 остатка между доменами II и III и для 123 остатков между доменами I и III были рассчитаны как 2.66 Å, 2,33 Å и 1,93 Å соответственно.

Из структуры сокристаллической β-Clamp E. coli с ДНК ²¹ , а также из структуры с ее взаимодействующими партнерами ^22,23,24,25 . Уже известно, что домены I и II участвуют в связывании ДНК, а домены II и III имеют сайт для взаимодействия с различными белками, связывающими β-clip. Двойная роль домена II в связывании ДНК и белков согласуется с его хорошей суперпозицией с двумя другими доменами в нашей структуре Hpβ-Clamp.Как и в других зажимах, двенадцать альфа-спиралей образуют внутреннюю поверхность зажимного кольца Hpβ с положительно заряженными остатками, подходящими для связывания ДНК. Установлено, что β-листы вместе с петлями образуют внешнюю поверхность кольца.

Димерные интерфейсные остатки

Как видно из β-Clamp от других организмов, Hpβ-Clamp формирует димер «голова к хвосту», то есть N-конец одного мономера, взаимодействующий с C-концом другого мономера. Остатки, взаимодействующие между цепью A и цепью B на димерной границе, показаны на рис.2, Таблица S1. Несколько ионных и неионных взаимодействий указывают на стабильный димер, образующий кольцевую структуру. Два солевых мостика образуются между Glu266 и Glu298 цепи A с Lys83 и Lys74 цепи B, а другой набор эквивалентных солевых мостиков также образован между Glu 266 цепи B и Lys 83 цепи A и между Glu 298 цепи B и Lys 74. цепи А. Было обнаружено, что эти солевые мостики и несколько гидрофобных взаимодействий опосредуют ассоциацию между мономерами. В целом, наблюдение относительно положительно заряженного N-концевого домена и отрицательно заряженного C-концевого домена (Рисунок S4) согласуется с ионными взаимодействиями, доминирующими над димеризацией H.pylori β-зажим.

Рисунок 2

Остатки на границе раздела димеров.

( A ) Мультяшное изображение димерной границы между двумя цепями. На границе образуются различные ионные и гидрофобные взаимодействия. Солевые мостики, образованные между остатком Glu266 цепи A и Lys83 цепи B и между Glu298 цепи A и Lys74 цепи B, показаны на этом рисунке. Другой набор эквивалентных солевых мостиков также образован между Glu 266 цепи B и Lys 83 цепи A и между Glu 298 цепи B и Lys 74 цепи A в этой гомодимерной структуре.( B ) Графическое изображение различных остатков, участвующих во взаимодействии между двумя цепями A, B. ( C ) Таблица, описывающая расстояние между атомами, взаимодействующими на димерной границе раздела.

Сравнение структуры Hpβ-Clamp со структурами других организмов

Несмотря на то, что суперпозиция показала, что общая структура Hpβ-Clamp похожа на структуры β-Clamp у других организмов, существуют некоторые важные различия в задействованных областях в связывании ДНК (рис.3). Распределение электростатического поверхностного заряда Hpβ-Clamp и всех его гомологов было рассчитано с использованием подключаемого модуля ABPS ⁵ в PyMOL (рисунок S4). Было обнаружено, что N-концевой участок Hpβ-зажима имеет больше электроположительных остатков, а С-концевой участок больше электроотрицательных остатков на димерной границе раздела. Это распределение аналогично таковому в β-зажиме E. coli , но отличается от распределения в T.maritima и S.pyogenes , где заряды на димерной границе раздела распределены равномерно.

Рисунок 3

Структурное выравнивание Hpβ-зажима с ДНК-связанным Ecβ-зажимом и другими гомологами.

( A ) Наложение Hpβ-зажима на связанный с ДНК Ecβ-зажим дало RMSD 1,7 Å. Наложение было выполнено для анализа остатков Hpβ-Clamp, соответствующих остаткам Ecβclamp, участвующим в связывании ДНК. ( B ) Увеличенное изображение специфических ДНК-связывающих областей с целью демонстрации различий между Hpβ-Clamp и его гомологами показало, что ориентация петли домена I, содержащей (в нумерации Hpβ-Clamp) остатки 20–28, является вполне приемлемой. отличается в H.pylori , чем в любом из его гомологов, хотя с Lys23 Hpβ-зажима (соответствующего ДНК-связывающему Arg24 в E. coli ) все еще находится в положении, близком к ДНК. ( C ) Увеличенное изображение петли домена II, содержащей (в нумерации Hpβ-зажимов) остатки 210–214, которая соответствует петле в Ecβ-зажиме, содержащей ДНК-связывающие Asp208 и Gly209, показало, что эта петля уникально коротка в Hpβ- зажим. ( D ) Петля β-зажимного домена III, содержащая остатки 355–365, была больше у H.pylori, M. tuberculosis и M.smegmatis , чем у других организмов.

ДНК-связывающая область Hpβ-Clamp

Структурное выравнивание между Hpβ-Clamp и гомологичными β-зажимами других организмов показало общее сходство по структуре (Рис. 3A), но с некоторыми существенными различиями (Рис. 3B – D) . Остатки, участвующие во взаимодействиях ДНК в E. coli вместе с соответствующими остатками в H. pylori и других организмах, приведены в Таблице S2.Возможно, наиболее примечательно то, что две основные ДНК-взаимодействующие петли β-зажима, как наблюдали, приняли совершенно разные конформации у H. pylori по сравнению с β-зажимом у E. coli и других организмов.

Было обнаружено, что петля, охватывающая остатки с 20 по 28 из домена I, ориентирована в противоположном направлении в Hpβ-Clamp структуре по сравнению с соответствующей петлей в Clamp-структурах других организмов (Fig. 3B). В совместной структуре β-зажима E. coli с ДНК (код PDB: 3BEP) Arg24 взаимодействует с ДНК.Несмотря на противоположно ориентированные петли, наша суперпозиция Hpβ-зажима с ДНК-связанным Ecβ-зажимом показала, что боковая цепь Hpβ-зажима Lys23 (который соответствует Ecβ-зажиму Arg 24) все еще находится в положении, близком к ДНК, что позволяет предположить, что Lys23 Hpβ-Clamp может участвовать в связывании ДНК и может иметь решающее значение для связывания с ДНК. Средний B-фактор для этой области, по расчетам, был больше для E. coli (с ДНК и без нее) и других организмов по сравнению с H. pylori (Таблица S3), что указывает на то, что эта петля относительно жесткая в Hpβ- зажим, но гибкий в β-зажимах других организмов.

В домене II петля, содержащая остатки 210–214, оказалась короче в Hpβ-clamp, чем в E. coli и других гомологах (рис. 3C). Остатки Asp208 и Gly209 в соответствующей петле в E. coli участвуют во взаимодействиях ДНК. Более того, у E. coli и других гомологов было обнаружено, что B-фактор для этой области довольно высок по сравнению с таковым для других областей в белке, в отличие от случая H. pylori .Эти результаты показывают, что эта петля в другом организме может взаимодействовать с ДНК, однако эта укороченная петля в H. pylori может не участвовать во взаимодействиях ДНК из-за отсутствия определенных остатков.

В дополнение к этим двум петлям, другое различие в Hpβ-зажиме наблюдалось в центральном канале зажимной структуры рядом с участком связывания ДНК в петле, включающей остатки 355–365 (рис. 3D). Эта петля была намного больше в зажимах H.pylori, M. tuberculosis и M. smegmatis , чем в E. coli и других гомологах. Более того, в случае E. coli было обнаружено, что средний B-фактор для этой петли близок к среднему значению B, но у H. pylori , M. tuberculosis и M.smegmatis, он оказался выше. по сравнению с их средними значениями B. Это указывает на гибкость этой петли у H. pylori и этих двух организмов. Кроме того, в H. pylori эта петля выстлана основными остатками K357, h460 и K364.Кроме того, значение этой петли подтверждается ее присутствием в виде больших петель у обоих видов микобактерий. Эти наблюдения подтверждают, что петля 355–365 д. Участвовать во взаимодействиях Hpβ-clamp-ДНК, даже если соответствующая область в Ecβ-clamp не участвует в связывании ДНК.

Поиск белков, которые связывают Hpβ-Clamp

Сокристаллические структуры Ecβ-Clamp с пептидами из Pol II (PDB ID: 3D1E) ⁴ , альфа-субъединица Pol III (PDB ID: 3D1F) ⁴ и Pol V (PDB ID: 4K74) ²² , а также с короткими участками белка дельта-субъединицы Pol III (PDB ID: 1JQL) ²³ и Pol IV (PDB ID: 1UNN) ²⁴ были депонированы в PDB.Многие белки, участвующие в инициации репликации, которые связывают β-зажим, были идентифицированы / аннотированы в E. coli , но еще не в H. pylori . Мы провели поиск в базе данных NCBI и обнаружили, что альфа- и дельта-субъединицы ДНК pol III и ДНК-лигазы хорошо аннотированы в H. pylori . На основании этих результатов мы провели поиск областей связывания β-Clamp в альфа-субъединице Pol III и в ДНК-лигазе.

Альфа-субъединица ДНК pol III в

H. pylori

В E.coli , из нескольких ее партнеров, взаимодействующих с β-clip, одним из важных таких партнеров является альфа-субъединица ДНК-полимеразы III, которая катализирует полимеразную активность холоферментного комплекса ²⁶ . Здесь существует двусторонняя ассоциация β-зажима и альфа-субъединицы ДНК pol III. В этой альфа-субъединице E. coli ²⁷ есть два сайта связывания: один находится рядом с С-концом (остатки 1154–1159 (QVELEF)), а другой — в середине субъединицы (остатки 920–924). (QADMF)) ²⁷ .Мутация в любом сайте связывания влияет на репликацию хромосомы. Поскольку эти сайты важны для активности полимеразы, они представляют большой интерес. В нашем исследовании мы идентифицировали один из этих сайтов в альфа-субъединице H. pylori ДНК Pol III. Мы предсказали, что Hpβ-Clamp взаимодействует с альфа-субъединицей ДНК Pol III с последовательностью 953QGGNSLF959, которая близка к С-концевой области этой субъединицы.

ДНК-лигаза H. pylori имеет сайт связывания β-зажима

Помимо альфа-субъединицы ДНК Pol III, ДНК-лигаза также является интересным партнером по связыванию скользящих зажимов.У эукариот (в частности, Sulfolobus solfataricus ) взаимодействие между PCNA и ДНК-лигазой хорошо изучено ²⁸ . В случае прокариот взаимодействие между β-clip и ДНК-лигазой подробно не изучено. Лопес де Саро и О’Доннелл ¹⁰ исследовали Ecβ-Clamp на его взаимодействие с лигазой EcDNA, выполнив анализ сдвига подвижности нативного геля. Они также определили, что MutL и MutS также будут связываться с β-зажимом в E. coli . Однако Вандана Кукшал и соавт. ¹¹ сообщили, что ДНК-лигаза M. tuberculosis не взаимодействует с β-зажимом, и они предположили, что может быть задействован какой-то другой фактор, который способствует взаимодействию между этими двумя белками. Такие находки заставили нас задуматься о том, существует ли взаимодействие между лигазой HpDNA и Hpβ-Clamp, или задействован какой-либо другой фактор, который опосредует взаимодействие между этими двумя белками. Основываясь на текущем понимании мотивов связывания β-Clamp ^7,29 , мы предсказываем последовательность ₅₅₄ QEFIRSLF ₅₆₁ рядом с С-концевым доменом BRCT H.pylori , чтобы быть сайтом связывания Hpβ-зажима. Обратите внимание, что сайт, взаимодействующий с β-зажимом в лигазе, ранее не сообщался ни в одном прокариотическом организме.

Докинговые исследования предполагают, что лигаза и α-субъединица Pol III могут связываться с Hpβ-clamp

Для оценки взаимодействий между Hpβ-clamp и каждым из двух сайтов, описанных выше, то есть одним из ДНК H. pylori Альфа-субъединица Pol III и субъединица ДНК-лигазы H. pylori , были проведены исследования стыковки Hpβ-clamp с короткими пептидами из каждого из этих двух сайтов.Информация о сайте связывания β-Clamp была расшифрована из сокристаллической структуры β-Clamp E. coli с β-Clamp-связывающим пептидом из альфа-субъединицы E. coli Pol III (PDB id 3D1F) ⁴ . Значения энергии связывания, рассчитанные для Hpβ-зажима с пептидом из альфа-субъединицы ДНК Pol III, а также с ДНК-лигазой, были сопоставимы с энергией связывания для Ecβ-зажима с пептидом из его альфа-субъединицы Pol III (Таблица S4).

Подтверждение взаимодействий между Hpβ-Clamp и Hpβ-Clamp-связывающими областями в лигазе / α-субъединице Pol III исследованиями SPR

Мы далее экспериментально подтвердили связывание этих областей с Hpβ-зажимом посредством SPR путем иммобилизации Hpβ- зажимают поверхность сенсорного чипа и пропускают пептиды различной концентрации по поверхности чипа (рис.4). Пептид из альфа показал аффинность связывания в миллимолярном диапазоне. Для дальнейшего подтверждения молекулярного взаимодействия между Hpβ-Clamp и Hpligase были проведены исследования взаимодействия на основе SPR с использованием Hpβ-clamp в качестве лиганда и лигазы HpDNA в качестве аналита. Было обнаружено, что взаимодействие между ними находится в микромолярном диапазоне: в частности, сродство лигазы HpDNA к Hpβ-clamp было рассчитано и составило 1,25 мкМ (фиг. 4D). Мы также проверили взаимодействие между Hpβ-зажимом и лигазой HpDNA с помощью эксперимента SAXS (рисунок S5).Радиус инерции (Rg) только для β-Clamp и лигазы был рассчитан как 3,87 с Dmax 9,8 нМ и 4,73 с Dmax 14,5 нМ соответственно. Однако Rg для смеси β-clamp и лигазы был рассчитан как 6,3 с Dmax 22 нМ, что свидетельствует об образовании комплекса.

Рисунок 4

Сенсограммы SPR, измеряющие взаимодействие Hpβ-Clamp (лиганда) с пептидами (аналитами) от его взаимодействующих партнеров и с полноразмерной лигазой HpDNA.

Область связывания Hpβ-зажима в альфа-субъединице ДНК Pol III и ДНК-лигазы стыковали, и пептиды из этих областей генерировались и в различных концентрациях проходили через β-зажим, который иммобилизовали на чипе.Поскольку пептиды очень малы, а наш Autolab SPR не очень чувствителен к таким экспериментам, генерируемые сигналы были очень слабыми. Фаза ассоциации длилась до 100 секунд после начала диссоциации. ( A ) Случайный пептид (EQDSLFGG) был взят в качестве контроля. ( B ) Исследование взаимодействия с пептидом из С-концевой области альфа-субъединицы ДНК PolIII с концентрациями от 100 мкМ до 1,7 мМ. ( C ) Исследование взаимодействия пептида из лигазы HpDNA в концентрациях от 1 мМ до 2.4 мМ. ( D ) Исследование взаимодействия β-Clamp с полноразмерной ДНК-лигазой в диапазоне от 100 нМ до 2 мкМ. Рассчитанное сродство лигазы к β-зажиму составило 1,25 мкМ.

Подтверждение наличия пептида

₅₅₄ QEFIRSLF ₅₆₁ из лигазы в виде области связывания Hpβ-Clamp посредством совместной кристаллизации

Для проверки области в лигазе HpDNA, которую мы предсказали как область связывания Hpβ-Clamp, мы совместно кристаллизовали Hpβ -зажим с пептидом ₅₅₄ QEFIRSLF ₅₆₁ из ДНК-лигазы.Структура сокристалла принадлежит пространственной группе P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ с четырьмя мономерами, образующими два димера (первый над вторым) на асимметричную единицу (рис. 5A). Было обнаружено, что из двух димеров пептид занимает оба сайта связывания первого димера (фиг. 5B), в то время как второй димер зажима не показывает никакого связанного с ними пептида. Интересно, что расположение молекул в кристалле таково, что один из пептидов (цепь L) наблюдается между двумя цепями (цепь D и цепь B) двух соседних асимметричных единиц, взаимодействуя с обеими цепями.Однако не было обнаружено такого контакта для другого пептида (цепь G), занимающего другую сторону димера, то есть пептида, который, как видно, взаимодействует только с одной цепью β-зажима A. Другими словами, один пептид (цепь L) связан с двумя молекулами β -clamp (Цепи B и D), в то время как другой пептид (Цепь G) связывается с одним β-зажимом (Цепь A). Этот вид взаимодействий, связанных с симметрией, должен быть кристаллическим артефактом и не должен иметь никакого функционального значения, в то время как общий способ связывания в обеих цепях (цепи A и D) должен быть связан с функциональным значением.Карта электронной плотности 2Fo-Fc (фиг. 5C) для пептида, связанного с Hpβ-зажимом, и температурные факторы пептида сопоставимы с β-зажимом, что указывает на сильное связывание. Связывание пептида с карманом связывания бета-зажима определяется гидрофобными взаимодействиями. Из восьми остатков пептида ₅₅₄ QEFIRSLF _561, плотность для Gln554 и Glu555 отсутствовала в обеих цепях. Ile557, Leu560 и Phe561 взаимодействуют с остатками, которые присутствуют в щели между доменами II и III в обеих цепях (рис.6), что свидетельствует об их важности для взаимодействия с β-зажимом. Arg558 цепи L образует водородную связь с остатками P371 и T373 цепи D. Цепь A ориентирована немного по-разному, K176 и T175 образуют водородную связь с I557 и L560 пептидной цепи L соответственно. Всего остатки Thr173, Thr175, Lys 176, Leu178, Ile248, Pro347, Met 370, Pro371, Ile372, Thr373 из цепи A и цепи D β-Clamp участвуют во взаимодействии с обеими пептидными цепями (цепь G и цепь L). почти аналогичным образом.

Рисунок 5

Кристаллическая структура Hpβ-зажима, связанного с пептидом из лигазы HpDNA.

( A ) Изображение двух соседних асимметричных единиц в связанном лигазным пептидом β-зажиме. Расположение молекул таково, что пептид, связанный с цепью D, также взаимодействует с цепью B. Однако такого взаимодействия не существует для другого пептида (цепь G), связанного с цепью A. Увеличенное изображение пептида, связанного с консервативным связыванием. карман бета-зажима таким образом, что кажется, что он присутствует на границе между двумя асимметричными единицами, где Phe556 взаимодействует с другой субъединицей (т.е.е., между цепью B одной асимметричной единицы и цепью D другой асимметричной единицы). ( B ) Изображение димера β-Clamp, показывающее расположение связанного пептида. Пептид, связанный с консервативным узлом связывания, расположен между доменом II и доменом III. ( C ) Карта электронной плотности 2Fo-Fc при 1,0σ пептида из HpDNA-лигазы, связанной с Hpβ-зажимом. Пептид, электронная плотность которого показана здесь, связан с цепью A. Электронная плотность для пептида (FIRSLF) видна, однако для концевых остатков (Q554 и E555) электронная плотность отсутствует.

Рисунок 6

Взаимодействие между пептидом лигазы и остатками в кармане связывания белка Hpβ-Clamp.

( A ) Мультяшное изображение белок-связывающего кармана цепи бета-зажима А. Взаимодействующие остатки β-зажима показаны в виде палочки. ( B ) Лиг-график связанной с пептидом цепочки бета-зажима A. Связывание пептида с карманом бета-зажима определялось гидрофобными взаимодействиями наряду с двумя водородными связями, образованными Thr175 и Lys176 β-зажима с Leu560 и Ile557 пептида. .( C ) Карикатурное изображение кармана связывания белка бета-зажимной цепи D. Взаимодействующие остатки β-зажима представлены палочками. ( D ) Лиг-график связанной с пептидом цепи β-зажима D. Все остатки β-зажима, как было показано, здесь образуют гидрофобные взаимодействия с пептидом. Оба остатка Phe371 и Thr373 β-Clamp образуют водородную связь с Arg558 пептида; T175 β-зажима образуют водородную связь с Leu560. Остатки, которые являются консервативными в обеих пептидных цепях G и L, окрашены в зеленый цвет.

Структурное выравнивание нативной структуры β-Clamp с цепью A и цепью D структуры комплекса β-Clamp дало RMSD 1,17 и 1,07, что предполагает небольшое перемещение этой области при связывании пептида. Сравнение нативной структуры β-зажима со структурой связанного с пептидом β-зажима показало различия в положениях некоторых из остатков в белок-связывающем кармане β-зажима (рис. S6). Остатки, участвующие в связывании пептида, обнаруживают максимальное локальное смещение, было обнаружено, что положения остатков Lys176 и M370 β-Clamp различаются между этими двумя структурами по сравнению с нативной структурой.В структуре, связанной с пептидом, оба они ориентированы в противоположных направлениях по сравнению с их исходной ориентацией в нативной структуре. Остатки T173, T175, I178, I248, M370, P371, I372 и T373 в связывающем кармане смещаются из своих нативных положений, создавая абсолютную щель. Такое движение этих остатков помогает в формировании непрерывного участка щели, которая восприимчива к связыванию взаимодействующего партнера. Примечательно, что остаток Thr175 β-Clamp в обеих цепях образует водородную связь с азотом основной цепи Leu560 из пептида, предполагая, что это должен быть консервативный остаток в кармане связывания белка.

Сравнение области связывания белка Hpβ-Clamp с областями связывания белка других гомологов показывает некоторые различия в петлях в сайте связывания белка, но связывание наблюдается в аналогичной бороздке между доменами II и III (рис. S7). Сравнение пептидных структур E. coli [Пептиды из ДНК E. coli pol. II (PDB id: 3D1E), дельта-субъединица ДНК pol. III (PDB id: 1JQL), альфа-субъединица ДНК pol. III (PDB id: 3D1F), домен мизинца ДНК pol.IV (PDB id: 1UNN) и pol.V (PDB id: 4K74)] с лигазным пептидом, связанным H. pylori , структура β-Clamp показывает, что характер связывания белков, взаимодействующих с β-Clamp, одинаков с небольшими различиями (рис. 7) и указывает на консервативный способ связывания связывающих β-зажим белков. Во всех пептидных взаимодействиях преобладают гидрофобные остатки, особенно те, которые связываются с субсайтом I.

Рисунок 7

Структурное выравнивание пептида лигазы, связанного с зажимом Hpβ, с другим связанным пептидом E.coli β-Clamp структуры.

( A ) Структурное сравнение структур, связанных с β-Clamp-пептидом E. coli , со структурой, связанной с Hpβ-Clamp-лигазой, показывает, что взаимодействующие с β-clip партнеры взаимодействуют очень сходным образом. Большинство взаимодействующих остатков в β-clip консервативны. Цветовой код для различных структур, используемых для этого сопоставления, следующий: Комплекс β-Clamp H. pylori с пептидом из ДНК-лигазы (FIRSLF) (голубой), Комплекс β-Clamp E. coli с субъединицей дельта (QAMSLF) (красный), E.coli β-Clamp-комплекс с pol IV (ERQLVLGL) (розовый), β-Clamp-комплекс E. coli с пептидом из альфа-субъединицы ДНК pol III (SEQVELEFD) (коричневый), β-Clamp-комплекс E. coli с пептидом из Pol V (QLNLF) (синий), комплекс β-Clamp E. coli с пептидом из pol II (QGLGLF) (желтый). ( B ) Поверхностное представление щели, связывающей белок β-Clamp. Последние пять остатков пептида (IRSLF) в лигазе HpDNA и соответствующие остатки в E.Партнеры связывания coli в основном ответственны за связывание.

Пептид ₅₅₄ QEFIRSLF ₅₆₁ расположен рядом с С-концевым доменом BRCT лигазы. Обратите внимание, что BRCT обозначает C-концевой домен белка предрасположенности к раку молочной железы, и этот домен расположен в C-концевой части белка BRCA-1, ген которого находится на длинном плече хромосомы 17. Большинство белков в этом BRCT family участвуют в регуляции клеточного цикла или в репарации ДНК, предполагая роль этих доменов BRCT в этих путях.Также считается, что эти домены функционируют как белок-белок взаимодействующий фрагмент. На основании результатов стыковки пептидов, SPR пептида, SPR полноразмерной лигазы-Hpβ-Clamp и сокристаллической структуры, область около С-концевой области домена BRCT, т.е. та, которая содержит QEFIRSLF, по-видимому, участвует в связывание Hpβ-зажима. Кроме того, в будущем важность этих пептидов может быть определена путем выполнения функционального анализа, мутационного анализа, включая изучение их полного белкового комплекса (в растворе с использованием SAXS или EM) или исследований взаимодействия SPR.

Кинетический анализ связывания и высвобождения зажима PCNA в реакции загрузки зажима, катализируемой фактором репликации C Saccharomyces cerevisiae

Abstract

ДНК-полимеразам требуется скользящий зажим для достижения процессивного синтеза ДНК. Тороидальные зажимы загружаются на ДНК с помощью загрузчиков зажимов, членов семейства АТФаз AAA +. Эти ферменты используют энергию связывания и гидролиза АТФ для выполнения множества клеточных функций. В этом исследовании был разработан анализ связывания зажима-загрузчика-зажима для измерения скорости АТФ-зависимого связывания зажима и зависимого от АТФ высвобождения зажима для S.cerevisiae зажим-загрузчик (RFC) и зажим (PCNA). Кинетика связывания PCNA до установившегося состояния показала, что, хотя связывание ATP с RFC увеличивает сродство к PCNA, скорости связывания ATP и зависимые от ATP конформационные изменения в RFC являются быстрыми по сравнению со скоростями связывания PCNA. Интересно, что RFC связывает PCNA быстрее, чем загрузчик γ-зажима Escherichia coli γ связывает β-зажим. В процессе загрузки зажимов на ДНК, RFC поддерживает контакт с PCNA, в то время как PCNA закрывается, поскольку наблюдаемая скорость закрытия PCNA выше, чем скорость высвобождения PCNA, что исключает возможность диссоциации открытого зажима от ДНК.Скорости закрытия и высвобождения зажима не зависят от скорости стадии связывания ДНК, а также ниже, чем сообщаемые скорости гидролиза АТФ, показывая, что эти скорости отражают уникальные стадии внутримолекулярной реакции в пути загрузки зажима.

Ключевые слова: репликация ДНК , загрузчик зажима, скользящий зажим, фактор репликации C (RFC), ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), AAA + ATPase

1. ВВЕДЕНИЕ

Скользящие зажимы представляют собой тороидальные белки, которые охватывают дуплексную ДНК и трос. ДНК-полимеразы к матричной ДНК, тем самым уменьшая количество событий связывания и ограничивая диссоциацию.Таким образом, скорость синтеза ДНК ограничена скоростью включения нуклеотидов (см. Обзор в [1]). У эукариот репликативный скользящий зажим, ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA), является гомотримером субъединиц, расположенных по типу «голова к хвосту» [2–4]. PCNA необходим не только для репликации ДНК, но также и для множества др. Клеточных функций, включая пути репарации ДНК, ремоделирование хроматина и сцепление сестринских хроматид (rev. [5]). В каждом случае требуется загрузчик зажимов для загрузки PCNA в ДНК.Первичный загрузчик зажимов, необходимый для репликации ДНК, фактор репликации C (RFC), представляет собой гетеропентамерный комплекс, принадлежащий к семейству ААА + АТФаз [6-10]. Эти молекулярные моторы используют энергию связывания и гидролиза АТФ для нагрузки зажимов на ДНК (см. Обзор [11]). Реакция на загрузку зажима сложна и включает в себя множество этапов и конформационных изменений в загрузчике и зажиме. Проще говоря, RFC в присутствии АТФ связывается с зажимом и ДНК, образуя промежуточный тройной комплекс [12–18].Образование этого комплекса вызывает конформационные изменения, которые вызывают гидролиз АТФ, заставляя RFC высвобождать PCNA на ДНК [17,19–23]. Однако для завершения одного цикла реакции нагрузки зажима требуется множество отдельных кинетических этапов. В этом исследовании мы разработали анализ на основе флуоресценции для конкретного измерения взаимодействий связывания RFC-PCNA. Этот метод использовался для характеристики АТФ-зависимого связывания RFC с PCNA и для сравнения относительных скоростей закрытия PCNA вокруг ДНК с диссоциацией PCNA от RFC во время продуктивной реакции загрузки зажима.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2. 1. Буферы и реагенты

Буфер для анализа RFC состоит из 30 мМ HEPES pH 7,5, 150 мМ хлорида натрия (NaCl), 2 мМ дитиотреитола (DTT), 10 мМ хлорида магния (MgCl). ₂ ) и 10% глицерина. Буфер для анализа γ-комплекса состоит из 20 мМ Трис-HCl pH 7,5, 50 мМ NaCl, 8 мМ MgCl ₂ и 10% глицерина. Буфер для хранения PCNA содержит 30 мМ HEPES pH 7,5, 0,5 мМ EDTA, 2 мМ DTT, 150 мМ NaCl и 10% глицерин. Буфер для хранения RFC такой же, как и для PCNA, за исключением того, что концентрация NaCl была увеличена до 300 мМ.Буферы для хранения γ-комплекса и β-пирена (β-PY) описаны ранее [24].

Концентрации АТФ (GE Healthcare), разбавленного 30 мМ HEPES pH 7,5, определяли по оптической плотности при 259 нм и с использованием коэффициента экстинкции 15 400 M ^-1 см ^-1 .

2. 2. Белки

Экспрессионные векторы RFC и PCNA были предоставлены M. O’Donnell и его коллегами (Университет Рокфеллера) [25,26]. RFC, содержащий усеченный белок Rfc1, лишенный первых 283 аминокислот, был экспрессирован, как описано ранее [27–29].Сайт-направленный мутагенез кодирующей последовательности PCNA превращал встречающиеся в природе остатки Cys 22, 62 и 81 в Ser, Ser-43 в Cys для мечения связывающего мутанта и Ile-111 и Ile-181 в Cys для мечения открывающегося мутанта как сообщалось ранее [30]. PCNA экспрессировали, очищали и метили, как описано ранее [2,30,31], с небольшими модификациями. RFC был выражен и очищен, как описано ранее [25,26,32], с небольшими модификациями. Субъединицы γ-зажима-загрузчика комплекса γ [33], δ [34], δ ‘[34] и χψ [35] были очищены, и комплекс γ (γ ₃ δδ′χψ) был восстановлен [36], как описано ранее.Β-зажим был очищен [37] и помечен пиреном [24], как описано ранее.

2. 3. Анализ стационарной флуоресценции

Все измерения в стационарном состоянии были выполнены и проанализированы, как описано ранее [38]. Конечные концентрации составляли 0,5 мМ АТФ, 5, 10 или 20 нМ PCNA-MDCC и 0–400 нМ RFC. Приведены средние значения и стандартные отклонения для трех независимых экспериментов, а средние относительные интенсивности и стандартные отклонения были нанесены на график и аппроксимированы с помощью Калейдаграфа [38].Константы диссоциации ( K _d ) были рассчитаны с использованием уравнения 1, где R _o и P _o — общие концентрации RFC и PCNA-MDCC, соответственно, и I _max и I _min — максимальная и минимальная интенсивности MDCC, соответственно.

Iobs = Kd + Ro + Po- (Kd + Ro + Po) 2-4RoPo2Po ∗ (Imax-Imin) + Imin

(1)

Конкурентное связывание RFC с PCNA-MDCC по сравнению с немеченым PCNA дикого типа (PCNA wt) получали путем последовательного добавления реагентов в кювету, начиная с буфера для анализа с АТФ, затем с PCNA-MDCC и немеченым PCNA дикого типа и, наконец, RFC.Конечные концентрации составляли: 0,5 мМ АТФ, 20 нМ PCNA-MDCC, 0-400 нМ PCNA веса и 20 нМ RFC. Спектры излучения корректировали на фон путем вычитания буферного сигнала. Относительные интенсивности MDCC рассчитывались из отношения излучения при 467 нм для PCNA-MDCC с RFC к PCNA-MDCC без RFC и наносились на график как функция концентрации PCNA wt и соответствовали уравнению (2) с использованием Калейдаграфа [38]. В уравнении 2 PCNA _MDCC — концентрация PCNA-MDCC (20 нМ), PCNA _wt — концентрация немеченого PCNA wt, I _max — интенсивность MDCC в отсутствие wt PCNA (установлено значение 1) и I _мин — сигнал при насыщающих концентрациях PCNA wt (подходит как регулируемый параметр, расчетное значение 0.74 ± 0,11) [30].

Iobs = (PCNAMDCCPCNAMDCC + PCNAwt) ∗ (Imax-Imin) + Imin

(2)

2. 4. Кинетические измерения перед установившимся состоянием 20 ° С. Эмиссионную флуоресценцию MDCC контролировали с использованием режущего фильтра 455 нм при возбуждении при 420 нм. Флуоресценцию испускания пирена контролировали с использованием режущего фильтра 365 нм при возбуждении на 345 нм. Эмиссию Alexa Fluor 488 контролировали с помощью отсекающего фильтра 515 нм при возбуждении на 495 нм.Для анализов связывания зажимов эксперименты проводили в режиме одного смешивания, смешивая равные объемы (60 мкл) двух растворов, содержащих реагенты, в буфере для анализа. Для анализов закрытия и высвобождения зажимов эксперименты проводились в режиме последовательного смешивания, в котором раствор RFC был смешан с раствором PCNA и ATP перед добавлением раствора ДНК и ATP. Усредняли восемь или более индивидуальных кинетических следов. Временные ходы были скорректированы с учетом фона путем вычитания сигнала для буфера. Для анализов высвобождения и закрытия PCNA раствор RFC, меченого PCNA и АТФ добавляли к раствору PCNA дикого типа, ДНК (при ее наличии) и АТФ в концентрациях, указанных в подписях к рисункам.Курсы времени были нормализованы по интенсивности в начале реакции. Скорость изменения флуоресценции,

k _obs , соответствовала единственному экспоненциальному затуханию [38]. Для реакций связывания зажимов раствор загрузчика зажимов (RFC или комплекс γ) и АТФ добавляли к раствору меченого зажима (PCNA-MDCC или β-PY) и АТФ в концентрациях, указанных в подписях к фигурам. Данные собирались в течение 4 секунд с интервалом 0,4 мс. Временные графики были разделены на флуоресценцию свободного зажима для получения относительного увеличения флуоресценции и согласованы с двойным экспоненциальным возрастанием (комплекс γ / β) или одиночным экспоненциальным ростом (RFC / PCNA) с использованием Kaleidagraph [38] для расчета наблюдаемых констант скорости, k _обс .

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3. 1. Равновесный RFC • Связывание с PCNA

Анализ на основе интенсивности флуоресценции был разработан для измерения связывания зажимов с помощью RFC во время цикла загрузки зажимов. Поверхностный остаток на PCNA, Ser-43, был изменен на Cys, чтобы ковалентно пометить этот сайт с помощью MDCC (). Три из четырех встречающихся в природе остатков Cys, 22, 62 и 81, в PCNA были преобразованы в Ser, чтобы обеспечить селективное мечение Cys-43 [30]. Четвертый встречающийся в природе остаток Cys не должен быть доступным для мечения растворителем в этих условиях [3].Прогнозируемый «след» RFC на PCNA после связывания таков, что RFC может взаимодействовать с двумя или более флуорофорами [4,39–41] (). Когда RFC связывает PCNA-MDCC, флуоресценция MDCC увеличивается примерно в три раза ().

Анализ связывания PCNA-MDCC для измерения равновесия RFC • Связывание PCNA

(A) Ленточные диаграммы PCNA (мономеры окрашены в пурпурный, желтый и голубой цвета), просматриваемые с лица, которое связывает RFC с прогнозируемым «следом» RFC, обозначенным цветные кружки (верхнее изображение) и от края (нижнее изображение) (PDB ID: 1SXJ [4]).Ser-43, который был изменен на Cys и помечен MDCC, показан желтыми сферами. (B) Спектры излучения 10 нМ PCNA-MDCC с (черная кривая) и без (серая кривая) 400 нМ RFC. (C) Увеличение флуоресценции MDCC, когда RFC связывает PCNA-MDCC, нанесено на график для среднего значения трех независимых экспериментов со стандартными отклонениями (планки ошибок). Сплошные линии через точки данных соответствуют уравнению 1 для расчета констант диссоциации, K _d значений. (D) Конкуренция связывания RFC с меченым PCNA – MDCC vs.показан немеченый PCNA для реакций, содержащих 20 нМ PCNA-MDCC и 20 нМ RFC. Средняя относительная интенсивность MDCC из трех независимых экспериментов нанесена на график со стандартными отклонениями (планки погрешностей). Эти данные соответствовали фракции меченого PCNA (уравнение 2).

Используя этот анализ, связывание RFC с PCNA измеряли в условиях равновесия в анализах с АТФ. Было выполнено три отдельных титрования при трех различных концентрациях PCNA (). Константы диссоциации, значения K _d , для RFC-PCNA-MDCC были рассчитаны на основе этих данных с использованием уравнения 1.Средние значения K _d из трех независимых экспериментов составили 5,5 ± 1,9 нМ, 7,9 ± 0,5 нМ и 9,6 ± 2,3 нМ для 5 (синий), 10 (черный) и 20 (оранжевый) нМ PCNA-MDCC, соответственно. Эти значения согласуются друг с другом и составляют в среднем 7,7 ± 2,3 нМ для девяти измерений. Этот K _d находится в пределах того же порядка величины, что и значение 1,3 нМ, измеренное в эксперименте с одним поверхностным плазмонным резонансом [14], и значения от 2,6 до 4,5 нМ, измеренные в тестах закрытия зажимов [30].

Чтобы определить, повлияли ли мутации, введенные в PCNA для маркировки, взаимодействия с RFC, был проведен анализ конкурентного связывания, в котором немеченая PCNA дикого типа (wt) конкурировала за связывание RFC с PCNA-MDCC. В этом анализе 20 нМ RFC добавляли к растворам 20 нМ PCNA-MDCC и увеличивающимся концентрациям PCNA wt (). Уменьшение флуоресценции MDCC с увеличением немеченого PCNA можно адекватно описать уравнением 2, которое просто учитывает долю общей PCNA, меченую MDCC, демонстрируя, что RFC связывается с одинаковым сродством как с PCNA-MDCC, так и с немеченым PCNA дикого типа.Вместе эти данные показывают, что RFC связывает PCNA-MDCC с таким же сродством, как PCNA дикого типа.

3. 2. Связывание PCNA перед установившимся состоянием с помощью RFC с преинкубацией АТФ и без нее.

Анализ связывания PCNA-MDCC использовали для определения константы скорости связывания RFC PCNA. В этих экспериментах предварительно инкубированный раствор RFC и 0,5 мМ АТФ быстро смешивали с раствором PCNA-MDCC и 0,5 мМ АТФ (). Скорость увеличения флуоресценции MDCC увеличивалась с увеличением концентрации RFC, как и ожидалось для реакции биомолекулярного связывания.Первая секунда времени реакции соответствовала единичным экспоненциальным возрастаниям для расчета наблюдаемых скоростей, k _obs , для связывания (сплошные черные линии через следы реакции), и эти k _obs значения были нанесены на график в виде функции концентрации RFC в. Линейная аппроксимация этих графиков k _obs дает очевидные постоянные скорости, k _{на (app)} , из наклонов [24]. Среднее значение трех независимых экспериментов с остановленным потоком дало значение k _{на (app)} = 1.4 ± 0,5 × 10 ⁸ M ⁻¹ с ⁻¹ для RFC-связывания PCNA-MDCC. Таким образом, RFC связывает PCNA быстро со скоростью, ограниченной диффузией.

Предварительно установившаяся кинетика связывания RFC PCNA

(A) RFC предварительно инкубировали с АТФ перед быстрым смешиванием с раствором PCNA-MDCC и АТФ. (B) Один только RFC был быстро смешан с раствором PCNA-MDCC и АТФ. Конечные концентрации на панелях A и B были одинаковыми: 20 нМ PCNA-MDCC, 0,5 мМ АТФ и 25 нМ (оранжевый), 50 нМ (серый), 100 нМ (коричневый), 200 нМ (зеленый) или 400 нМ ( синий) RFC в буфере для анализа.Увеличение интенсивности MDCC как функция времени эмпирически соответствует единичным экспоненциальным нарастаниям (черные линии через кривые) для расчета наблюдаемых темпов. (C) Наблюдаемые скорости, k _obs , для данных с предварительной инкубацией ATP из панели A (закрашенные символы, три независимых эксперимента) и без панели B предварительной инкубации ATP (открытые символы, два независимых эксперимента) нанесены на график против концентрация RFC. Линейная аппроксимация данных дает кажущуюся константу скорости, k _{on, app} (наклон).

Учитывая, что связывание АТФ с загрузчиком зажима способствует конформационным изменениям в загрузчике зажима, которые увеличивают его сродство к зажиму и ДНК, чтобы управлять реакцией загрузки зажима, был проведен эксперимент, чтобы определить, будут ли вызванные АТФ конформационные изменения отражаться в скорость связывания зажима. В этом эксперименте раствор RFC был быстро смешан с раствором PCNA-MDCC и 1 мМ АТФ (для получения конечной концентрации 0,5 мМ АТФ) в реакциях, в которых RFC не был предварительно инкубирован с АТФ ().Наблюдаемые скорости связывания, k _obs (сплошные черные линии через следы реакции) были рассчитаны на основе единичных экспоненциальных соответствий, и эти значения k _obs нанесены на график вместе со значениями для реакций, предварительно инкубированных с АТФ, для сравнения. Кажущееся значение k _{на (app)} , равное 1,1 × 10 ⁸ M ^-1 с ^-1 , было рассчитано на основе среднего значения линейных соответствий двух независимых экспериментов. Скорости связывания в пределах экспериментальной ошибки одинаковы, независимо от того, предварительно инкубируется RFC с АТФ или нет, что показывает, что АТФ-зависимые конформационные изменения не ограничивают скорость связывания RFC-PCNA.

3. 3. Сравнение кинетики связывания зажимов загрузчиками зажимов

S. cerevisiae и E. coli

Скорость, с которой RFC связывает PCNA, измеренная примерно в шесть раз выше, чем скорость, описанная для E Загрузчик зажимов .coli , γ-комплекс, связывающийся с β-зажимом [24]. Чтобы определить, является ли эта разница в скоростях реальной или вместо этого отражает различия в условиях реакции, таких как концентрации глицерина, которые влияют на вязкость, были проведены параллельные реакции связывания зажима с RFC и комплексом γ.Раствор зажима-загрузчика (RFC или комплекс γ) и 0,5 мМ АТФ быстро смешивали с раствором меченого зажима (PCNA-MDCC или β-PY) и 0,5 мМ АТФ (). Обе реакции содержали 10% глицерина. Динамика реакций, содержащих зажим 20 нМ и загрузчик зажима 200 нМ, нанесена на тот же график, чтобы подчеркнуть разницу в скоростях. Данные первой секунды временного графика для связывания γ-комплекса β соответствовали двойному экспоненциальному росту [24,42], а для RFC и PCNA — однократному экспоненциальному росту, чтобы рассчитать кажущуюся скорость, k _obs .В отличие от случая флуоресценции MDCC, флуоресценция PY чувствительна как к этапам связывания зажима, так и этапу раскрытия зажима [42], и, следовательно, зависимость времени связывания β-PY требует двойной экспоненциальной аппроксимации. Связывание RFC с PCNA происходило со скоростью 36 с ^-1 , тогда как скорость связывания комплекса γ с β-PY составляла 5,5 с ^-1 . Таким образом, RFC связывает PCNA примерно в 6,5 раз быстрее, чем комплекс γ связывает β [24], что хорошо согласуется с разницей в k _{на (app)} скоростях, измеренных в двух разных исследованиях.

Сравнение скоростей связывания зажимом для S. cerevisiae RFC и E. coli γ-комплекса

Над графиком показана схема схемы перемешивания с остановленным потоком. Увеличение интенсивности MDCC, когда RFC связывает PCNA-MDCC (оранжевая кривая), и увеличение интенсивности PY, когда комплекс γ связывает β-PY (синий), нанесены на график в той же шкале времени. Сплошные черные линии через временные ходы являются результатом эмпирической подгонки данных к одному экспоненциальному росту для RFC • PCNA и к двойному экспоненциальному росту для комплекса γ • β для расчета наблюдаемых скоростей.

3. 4. PCNA закрывается перед высвобождением на ДНК с помощью RFC

Уменьшение флуоресценции MDCC, которое происходит, когда PCNA-MDCC диссоциирует от RFC, можно использовать для отслеживания нагрузки зажимом на ДНК. В этих реакциях RFC предварительно инкубировали с PCNA-MDCC и АТФ в аналитическом буфере с образованием комплекса открытого зажима-загрузчика-зажима, и этот раствор быстро смешивали с раствором ДНК, немеченой PCNA и АТФ в аналитическом буфере (красный след ). Немеченую PCNA держали в избытке, чтобы ограничить реакцию единичным наблюдаемым оборотом.Чтобы определить, может ли этот анализ отличить пассивную диссоциацию зажима-загрузчика от зажима или активное высвобождение зажима на ДНК из-за нагрузки зажима, была проведена идентичная реакция, за исключением того, что ДНК была опущена, так что возможна только пассивная диссоциация ( , синий след). Временные ходы для обеих реакций были подобраны к единичным экспоненциальным затуханиям (сплошные черные линии) для оценки скорости освобождения зажима 0,048 с ^-1 и 0,31 с ^-1 для пассивной диссоциации (синяя кривая) и активной нагрузки зажима ( красный след) соответственно.Скорость пассивной диссоциации согласуется со скоростью 0,035 с ^-1 , сообщенной Gomes, и др., . как измерено с помощью SPR [14]. Временной ход реакции нагрузки зажима не является простым экспоненциальным спадом (или суммой экспонент), а вместо этого имеет более сигмоидальную форму с коротким запаздыванием до уменьшения флуоресценции, тогда как временной ход для пассивной диссоциации зажима соответствует простой экспоненциальный распад (совместимый с простым событием диссоциации). Более сложная форма графика нагрузки зажима отражает дополнительные этапы реакции, например.г. RFC-PCNA связывающая ДНК и RFC гидролизующий АТФ, которые «невидимы» с точки зрения флуоресценции MDCC. В целом, загрузка зажима примерно в 6 раз быстрее, чем пассивное освобождение зажима, и кинетически его можно отличить от пассивной диссоциации.

Закрытие зажима PCNA происходит быстрее, чем высвобождение PCNA по RFC

Закрытие PCNA и высвобождение PCNA измерялись в реальном времени, когда раствор RFC, меченый PCNA и АТФ был добавлен к раствору ДНК и немеченой ловушки PCNA. Все реакции содержали 20 нМ RFC, 20 нМ PCNA, 0.Указаны концентрации 5 мМ АТФ, 200 нМ немеченой PCNA и ДНК. Данные были эмпирически подогнаны к единичным экспоненциальным затуханиям для расчета скоростей. (A) Синяя кривая показывает реакцию, в которой ДНК была пропущена (, пассивное высвобождение, ), а красная кривая показывает реакцию, которая содержит ДНК (, загрузка активного зажима, ). (B) Высвобождение PCNA-MDCC на ДНК измеряли как функцию концентрации ДНК. (C) Закрытие PCNA-AF488 ₂ и высвобождение PCNA-MDCC на ДНК измеряли в идентичных условиях.(D) PCNA-AF488 ₂ закрытие измеряли как функцию концентрации ДНК.

Связывание ДНК запускает высвобождение PCNA из RFC во время реакции загрузки зажима. Чтобы определить, зависит ли кинетика высвобождения PCNA от этой стадии связывания ДНК второго порядка, измеряли скорость высвобождения зажима как функцию концентрации ДНК, 20 (красный), 40 (синий) и 100 (серый) нМ ДНК. Наблюдаемые скорости освобождения зажима были одинаковыми для каждой концентрации ДНК ( k _obs = 0.41 ± 0,04 с ^-1 ) () показывает, что скорость высвобождения зажима ограничивается скоростью внутримолекулярной реакции в комплексе RFC-PCNA-ДНК.

В предыдущей работе мы разработали анализ открытия / закрытия PCNA, в котором PCNA метится с обеих сторон каждого интерфейса мономера с помощью Alexa Fluor 488 (PCNA-AF488 ₂ ) [30]. Когда PCNA закрывается, молекулы AF488 взаимодействуют и гасятся, а когда RFC открывает PCNA, две молекулы AF488 разделяются и усиливают флуоресценцию.Этот анализ закрытия был проведен «бок о бок» с анализом высвобождения зажима, чтобы определить, закрывается ли PCNA при высвобождении RFC на ДНК или закрывается ли PCNA перед диссоциацией от RFC (). Для обеих реакций предварительно инкубированный раствор RFC, флуоресцентно меченый PCNA (либо PCNA-MDCC, либо PCNA-AF488 ₂ ) и АТФ смешивали с раствором ДНК и избытком немеченого PCNA в конечных концентрациях, указанных в легенде к рисунку. . Таким образом, к ДНК был добавлен комплекс загрузчик-зажим с открытым зажимом.Уменьшение флуоресценции AF488, которое происходит при закрытии зажима (черный график, k _close = 2,2 с ^-1 ), почти в 10 раз быстрее, чем уменьшение флуоресценции MDCC, которое происходит при отпускании зажима (синий график, ). k _release = 0,26 с ^-1 ) (), показывая, что PCNA закрывается до того, как будет выпущена в ДНК посредством RFC. Как и в случае скорости высвобождения, скорость закрытия PCNA также не зависит от концентрации ДНК ( k _obs = 6,4 ± 1.5 с ⁻¹ ), а временные ходы имеют более сигмоидальную форму, чем экспоненциальную (). Следовательно, скорость закрытия и высвобождения зажима ограничивается реакцией, которая происходит после связывания ДНК и образования комплекса RFC-PCNA-ДНК. Эти данные показывают, что PCNA закрывается до отделения от RFC.

4. ОБСУЖДЕНИЕ

Реакция нагрузки зажима довольно сложна, поскольку для описания простого линейного пути реакции требуется не менее дюжины шагов [13,15,21,23,43–45]. Эти шаги включают связывание 4 или 5 молекул АТФ, связывание зажима, раскрытие зажима, связывание ДНК, гидролиз АТФ, закрытие зажима, высвобождение зажима, высвобождение ДНК, диссоциацию ADP / P _и и по крайней мере два конформационных изменения в RFC, вызванных Связывание и гидролиз АТФ.Также вероятны «ответвления» на пути, что еще больше усложняет ситуацию. Учитывая такое количество переменных, необходимы анализы для измерения как можно большего количества индивидуальных взаимодействий и реакций, чтобы надежно определить кинетический механизм пути реакции нагрузки зажима. В этой статье мы разработали анализ на основе флуоресценции для измерения реакций связывания и диссоциации RFC-PCNA.

Связывание АТФ с зажимом-загрузчиком запускает реакцию загрузки зажима за счет увеличения сродства зажимного загрузчика к зажиму и ДНК и за счет стабилизации открытой конформации зажима [12,14–16,42,46,47].Эти ATP-индуцированные конформационные изменения в загрузчике зажимов, вероятно, увеличивают контакты между RFC и PCNA для увеличения аффинности и стабилизации открытой конформации, что демонстрируется различиями в закрытом комплексе RFC-PCNA в сравнении и открытом зажимном загрузчике бактериофага Т4. • зажимной комплекс [4,39,41]. Чтобы определить, будут ли АТФ-индуцированные конформационные изменения в RFC отразиться на скоростях связывания PCNA, скорости связывания PCNA-MDCC измеряли в реакциях, в которых АТФ добавлялся к RFC одновременно с PCNA ().Если бы АТФ-индуцированные конформационные изменения были предпосылкой для связывания PCNA, то скорость связывания RFC-PCNA-MDCC увеличивалась бы с концентрацией RFC до концентрации, при которой скорость конформационных изменений была медленнее и становилась лимитирующей. Однако в этих реакциях скорости связывания RFC-PCNA линейно увеличивались с концентрацией RFC и не приближались к значению насыщения, ограниченному скоростью внутримолекулярной реакции. Кажущаяся скорость связывания была одинаковой независимо от того, был ли RFC полностью уравновешен с АТФ или был добавлен к PCNA и ATP одновременно, и оба происходили в контролируемых диффузией пределах.Таким образом, скорость индуцированных АТФ конформационных изменений в RFC не ограничивает скорость связывания RFC-PCNA. Это может быть связано с тем, что конформационные изменения, вызванные АТФ, чрезвычайно быстры и происходят намного быстрее, чем связывание RFC-PCNA при самых высоких измеренных концентрациях RFC. Или, учитывая, что связывание PCNA — это двухэтапная реакция, в которой RFC связывает PCNA, а PCNA открывается на втором этапе [30,47], другая интересная возможность состоит в том, что индуцированные АТФ конформационные изменения могут не потребоваться для начального связывания RFC-PCNA. , но вместо этого может возникнуть после образования комплекса RFC-PCNA для поддержки реакции открытия зажима.

In vitro , RFC, уравновешенный с АТФ, может сначала связывать либо PCNA, либо ДНК [15], однако, учитывая топологию макромолекул в клетке, маловероятно, что тройная RFC-PCNA-ДНК может образоваться, если RFC связан ДНК раньше PCNA. Одним из способов способствовать связыванию PCNA перед связыванием ДНК может быть кинетическое предпочтение связывания PCNA быстрее, чем ДНК. Это наблюдается в системе E. coli , где относительно медленное АТФ-индуцированное конформационное изменение в загрузчике зажима ограничивает скорость связывания ДНК, но не связывания с β-зажимом, так что связывание зажима происходит быстрее [24].Что касается β-зажима, скорость связывания PCNA с RFC не ограничивается скоростью ATP-индуцированных конформационных изменений в RFC, что позволяет предположить, что RFC также может иметь кинетическое предпочтение для связывания PCNA перед ДНК. В поддержку этой модели кинетический анализ показывает, что медленная АТФ-зависимая активация RFC происходит до связывания ДНК [44]. Таким образом, АТФ-индуцированные конформационные изменения в RFC могут не потребоваться для начальной стадии связывания PCNA, так что этот этап является быстрым, но вместо этого может облегчить стадию раскрытия PCNA вместе со связыванием ДНК.

Чтобы выявить сходства и различия в механизмах зажимной нагрузки в разных сферах жизни, мы напрямую сравнили зажимные загрузчики E. coli и S. cerevisiae , комплекс γ и RFC, соответственно. Сродство каждого из загрузчиков зажимов к зажимам аналогично: значение K _d , равное 7,7 ± нМ, было измерено здесь с использованием анализа связывания PCNA-MDCC и значение K _d , равное 3,2 ± 0,9 нМ. был измерен для связывания β комплекса E. coli γ с помощью SPR [48].Хотя и RFC, и комплекс γ связывают зажимы с аналогичной аффинностью, скорость, с которой RFC связывает PCNA, примерно в 6-7 раз быстрее, чем скорость, с которой комплекс γ связывает β (). Предварительно установившийся анализ связывания PCNA с помощью RFC, измеренный здесь, дал константу скорости бимолекулярного связывания 1,4 ± 0,3 × 10 ⁸ M ^-1 с ^-1 по сравнению со скоростью 2,3 × 10 ⁷ M ^-1 с ^-1 для γ-комплекса, связывающего β-зажим [24]. Различия в скорости связывания могут отражать различия в симметрии зажимов.β является гомодимером, тогда как PCNA является гомотримером, так что RFC может продуктивно связывать PCNA в трех возможных ориентациях, тогда как комплекс γ может связывать β только в двух продуктивных ориентациях. Хотя RFC связывает PCNA быстрее, чем комплекс γ связывает β, предыдущие исследования показали, что открытие PCNA (2 с ^-1 ) примерно в 4-5 раз медленнее, чем β-открытие (9 с ^-1 ) [30, 42, 47 ]. Оба загрузчика зажимов образуют комплексы загрузчик-зажим открытого зажима в двухэтапной реакции, в которой связывание зажима происходит до открытия зажима [30,42,47], таким образом, более высокая скорость связывания RFC уравновешивается более медленной скоростью открытия, так что общие скорости реакций связывания / открытия аналогичны.

Учитывая стабильность PCNA как замкнутого кольца [49,50], вполне возможно, что RFC просто высвобождает PCNA, а PCNA быстро «замыкается» вокруг ДНК. В этом типе механизма взаимодействия между положительно заряженными аминокислотными остатками, выстилающими центр зажима, и отрицательно заряженными фосфатами ДНК могут стабилизировать PCNA на ДНК, чтобы предотвратить диссоциацию PCNA до закрытия [3,51,52]. Однако этот механизм оставляет открытой возможность того, что PCNA может диссоциировать от ДНК перед закрытием.Чтобы определить, быстро ли закрывается PCNA после диссоциации от RFC или PCNA замыкается вокруг ДНК перед диссоциацией от RFC, скорости закрытия и высвобождения PCNA измеряли в идентичных условиях. Эти эксперименты напрямую показали, что PCNA замыкается вокруг ДНК быстрее, чем PCNA диссоциирует от RFC (). Таким образом, загрузчик зажима не оставляет открытой возможности того, что открытый зажим может отделиться от ДНК до того, как зажим закрывается. И скорости закрытия PCNA, и высвобождения PCNA не зависят от концентрации ДНК (), показывая, что они не зависят от скорости связывания ДНК второго порядка, но зависят от скорости внутримолекулярной реакции в зажимном загрузчике • зажим • ДНК-комплекс .Учитывая, что PCNA закрывается быстрее, чем высвобождение PCNA, шаги, которые регулируют скорости этих двух реакций, различаются. Этот кинетический порядок событий сохраняется у бактерий, у которых зажим E. coli смыкается вокруг ДНК быстрее, чем освобождается загрузчиком зажима [53]. Интересно, что скорость высвобождения PCNA-MDCC на ДНК в результате загрузки зажима примерно в пять раз ниже, чем сообщалось ранее для загрузки / высвобождения PCNA [23]. Наиболее вероятное объяснение этой разницы заключается в том, что в двух исследованиях были проведены разные измерения.В этом исследовании диссоциация PCNA контролировалась непосредственно по снижению флуоресценции MDCC, тогда как Chen et al . вместо этого контролировали высвобождение ДНК и предполагали, что PCNA высвобождается одновременно. Если интерпретировать оба исследования вместе, это будет означать, что RFC выпускает ДНК раньше, чем PCNA. Такой же порядок событий был предложен для реакции загрузки зажима E. coli [54]. Объединив результаты этого исследования и Chen et al. [44], вероятная серия событий, которая происходит после образования тройного комплекса RFC • PCNA • ДНК: АТФ гидролизуется, PCNA закрывается, ДНК высвобождается и, наконец, зажим освобождается.Это подчеркивает важность разработки конкретных анализов для измерения как можно большего количества индивидуальных взаимодействий и реакций в пути нагрузки зажима, чтобы прийти к кинетическому механизму, который согласуется со всеми измерениями.

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно.Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.
  Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом.Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г.,
  браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.
  Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie
потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт
не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к
остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

границ | Скользящие зажимы для ДНК как терапевтические мишени

Введение

ДНК-полимеразы, которые реплицируют хромосомную ДНК, не являются процессивными сами по себе и полимеризуют только несколько нуклеотидов за раз.У всех организмов процессивная репликация достигается за счет дополнительных факторов, включая белок, называемый «скользящим зажимом». Скользящий зажим представляет собой белок в форме кольца, который окружает дуплексную ДНК, связывается с ДНК-полимеразой и привязывает ее к матрице ДНК, предотвращая ее диссоциацию и обеспечивая высокую процессивность. Скользящий зажим не собирается вокруг ДНК, но загружается в ДНК по АТФ-зависимому механизму с помощью комплекса «загрузчик зажима». У всех организмов скользящие зажимы и загрузочные зажимы необходимы для жизнеспособности клеток.Помимо своей роли в репликации хромосомной ДНК, скользящие зажимы также играют важную роль в репарации ДНК, рекомбинации, а также в развитии и контроле клеточного цикла (Kelman and O’Donnell, 1995; Jeruzalmi et al., 2002; Vivona and Kelman, 2003 ). И у бактерий, и у эукарий многие белки взаимодействуют с помощью скользящих зажимов, и эти взаимодействия регулируют их биохимические свойства (Kelman and Hurwitz, 1998; Vivona and Kelman, 2003).

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA) представляет собой скользящий зажим эукариот (Kelman, 1997; Moldovan et al., 2007) и играет важную роль в репликации, репарации и рекомбинации хромосомной ДНК, а также в других клеточных процессах, таких как синтез трансфузии (Yang and Gao, 2018). PCNA образует стабильный гомотример. Фактор репликации C (RFC) использует энергию гидролиза АТФ для сборки тримерной PCNA вокруг дуплексной ДНК на стыке праймер-матрица на отстающей цепи. PCNA взаимодействует с двумя репликативными полимеразами, ДНК-полимеразами δ и ε (Polδ и Polε), белками, участвующими в созревании фрагментов Окадзаки [i.например, ДНК-лигаза и эндонуклеаза-1 лоскута (FEN-1)], белки, необходимые для репарации ДНК [апуриновая / апиримидиновая эндонуклеаза 1 и Xeroderma pigmentosum G, регуляторы клеточного цикла (например, p21)] и многие другие клеточные факторы. Белки PCNA репарации ДНК также часто модифицируются посттрансляционно, и тип посттрансляционной модификации направляет PCNA к различным процессам передачи сигналов (Wang, 2014).

ДНК-полимераза III (Pol III) — репликативная полимераза бактерий. Β-субъединица Pol III представляет собой бактериальный скользящий зажим, также называемый β-зажимом (Kuriyan and O’Donnell, 1993; Kelman and O’Donnell, 1995).Он образует стабильный димер и требует τ-комплекса для сборки вокруг соединения праймер-матрица АТФ-зависимым образом. Подобно эукариальной PCNA, β-зажим взаимодействует с репликативной полимеразой Pol III, а также с белками, участвующими в репарации ДНК (например, Pol II и Pol IV), регулятором клеточного цикла, DnaA и другими белками.

Скользящие зажимы

ДНК всех организмов имеют общую архитектуру. Это многодоменные, мультимерные белки, которые образуют тороидальную структуру с центральной порой диаметром ~ 35 Å, достаточно большой для размещения дуплексной ДНК, которая выстлана положительно заряженными боковыми цепями, в первую очередь Lys и Arg.PCNA — это тримерный белок, а β-зажим — димерный. Хотя существует низкая идентичность последовательностей между PCNA и β-clip (<15%), их трехмерные структуры почти совмещаются. Это происходит из-за схожей структуры доменов, составляющих каждую цепочку. Эти домены состоят из двух 4-нитевых β-листов, расположенных снаружи зажима ДНК, и двух α-спиралей, которые при сборке выстилают ядро ​​зажима. В каждом мономере димера β-зажима есть три домена и два домена в каждом мономере тримера PCNA, создавая псевдогексамерную симметрию, которая присутствует во всех зажимах ДНК (Kelman and O'Donnell, 1995) (рис. ).

Рисунок 1 . Скользящие зажимы для ДНК, демонстрирующие псевдогексамерную симметрию, и центральное отверстие кольцевой структуры, которое вмещает двухцепочечную ДНК. (A) Димер β-Clamp Escherichia coli , в котором один мономер окрашен в синий цвет, а другой — в оранжевый. Три подобных домена в каждом мономере обозначены как Dom I, II и III. Обозначен один из четырех контуров IDCL. Пептид AcQADLF с его поверхностью, окрашенной в зеленый цвет, показывает расположение одного из связывающих карманов.Второй связывающий карман, отмеченный стрелкой и пунктирной линией, в этой структуре пуст [PDBID: 4K30 (Zhao et al., 2013)]. (B) Тример PCNA человека с одним мономером оранжевого цвета, одним зеленым и третьим мономером синего цвета. Два домена в одном из мономеров обозначены как Dom I и II. Обозначен один из трех IDCL. Пептиды FEN-1 PIP нарисованы фиолетовым цветом, причем один из лигандов показан в виде молекулярной поверхности, а два других лиганда — в виде лент [PDBID: 1U7B (Bruning and Shamoo, 2004)].Молекулярный рендеринг был сделан с использованием Chimera (Pettersen et al., 2004).

Лицевая сторона зажима ДНК, которая указывает в направлении синтеза ДНК, известна как лицевая сторона и является местом взаимодействия для многих партнеров по связыванию. Сайты взаимодействия на зажимах ДНК в значительной степени гидрофобны и расположены рядом с доменами I и II в PCNA и доменами II и III в β-зажиме (рис. 1). Большинство белков, которые взаимодействуют с PCNA, делают это через консервативный мотив, называемый мотивом взаимодействующего пептида PCNA (PIP) (Warbrick, 1998; Warbrick et al., 1998). Эти мотивы PIP представляют собой короткие белковые сегменты, которые обычно расположены на С-конце взаимодействующих белков. Например, белок p21 действует как ингибитор циклин-зависимых протеинкиназ, которые контролируют начало S-фазы клеточного цикла и репликацию ДНК. Взаимодействия PCNA с p21 или C-концевым пептидом p21 могут ингибировать связывание других белков с PCNA и влиять на активность PCNA (Gibbs et al., 1997). С-концевой пептид p21 содержит мотив PIP и связывается с сайтом PIP (Gulbis et al., 1996). Мотив PIP представляет собой слабый консенсус Qxxhxxaa, где «h» — гидрофобная аминокислота (изолейцин, лейцин или метионин), а «a» — ароматический остаток (триптофан, тирозин или фенилаланин). Хотя мотив PIP является наиболее распространенной последовательностью взаимодействия между PCNA-взаимодействующими белками, сообщалось также, что другие мотивы связывают PCNA. Напр., AlkB гомолог 2 PCNA-взаимодействующий мотив (APIM) обычно обнаруживается в ферментах репарации ДНК (Gilljam et al., 2009). APIM представляет собой мотив из пяти остатков (K / R) (F / Y / W) (L / I / V / A) (L / I / V / A) (K / R), который связывается с сайтом PIP. в конформации, аналогичной пептидам PIP (Sebesta et al., 2017). Большая часть исследований терапевтических средств для PCNA сосредоточена на его роли в репарации ДНК, часто в сочетании с другими терапевтическими средствами (Gederaas et al., 2014; Inoue et al., 2014).

Аналогичная связывающая последовательность с зажимами бактериальной ДНК представляет собой линейный мотив из пяти остатков с канонической последовательностью QL (S / D) LF (Dalrymple et al., 2001) и называется мотивом связывания β-зажима (CBM). Пептидные последовательности, которые связываются с зажимами бактериальной и эукариальной ДНК, имеют несколько общих черт, а именно N-конец Q и две гидрофобные, часто ароматические аминокислоты на С-конце пептида.Однако общее количество аминокислот в последовательностях связывания зажима различается (восемь для PCNA и пять для β-зажима), и нет никакого сходства между оставшимися остатками. Поэтому неудивительно, что пептидные карманы на каждом из зажимов ДНК значительно различаются. По существу, пептиды, которые связываются с β-зажимом, не связываются с PCNA и наоборот (Flores-Rozas et al., 1994).

Так как зажимы ДНК действуют как связывающий «узел» со многими взаимодействующими белками (Kelman and Hurwitz, 1998), они обнаруживают определенную степень неупорядоченности сайтов связывания.Специфичность связывающего кармана зависит от консервативных остатков пептидного мотива, связывающегося с «горячими точками» рецептора-мишени (Yin et al., 2013). Любой эффективный ингибитор зажима ДНК должен плотно связываться, чтобы ингибировать синтез ДНК (Wolff et al., 2011) или репарацию. Первоначальные выводы для соединений, которые связываются с пептидными карманами на скользящих зажимах, часто обнаруживаются с помощью высокопроизводительного скрининга библиотек соединений для идентификации молекул, которые связываются с сайтом взаимодействия. Дальнейшая модификация этих основных соединений для оптимизации связывания с карманом измеряется с использованием клеточных анализов, измерений аффинности и структурных деталей.Скользящие зажимы ДНК необходимы для репликации и восстановления клеток и, как таковые, являются основной мишенью для разработки антипролиферативных и антибактериальных препаратов. Нынешнее появление во всем мире устойчивости к антибактериальным препаратам и распространение рака делают эти усилия актуальными и важными. В этом обзоре резюмируются исследования скользящих зажимов ДНК как мишеней для лекарств. Предыдущие обзоры, относящиеся к этой теме, включают (Bruck and O’Donnell, 2001; Kontopidis et al., 2005; Wang, 2014; Choe and Moldovan, 2016).

β-зажим

Бактериальный β-зажим представляет собой гомодимер ~ 82 кДа. Как описано выше, каждый мономер β-Clamp состоит из трех подобных глобулярных доменов, что приводит к общей псевдогексамерной симметрии (Kong et al., 1992). Домены каждого мономера имеют обширные взаимодействия вдоль соседних β-цепей и α-спиралей. Кроме того, между доменами имеется четыре гибких междоменных коннектора (IDCL), по две на каждый мономер. Интерфейс димера состоит из контактов β-цепи в расположении головы к хвосту (рис. 1A).Карман связывания пептида для CBM расположен рядом с IDCL доменов II и III и состоит из двух субсайтов: субсайта 1 между доменами II и III, глубина ~ 8,5 Å, и субсайта 2 в домене III, который более узкий и неглубокий на уровне ~ 4,5 Å глубиной. Использование нумерации от 1 до 5 для обозначения пяти канонических остатков CBM (Q ₁ L ₂ (S / D) ₃ L ₄ F ₅ ), остатков пептидного лиганда L ₄ и F ₅ связываются с субсайтом 1, тогда как остатки Q ₁ и L ₂ связываются с субсайтом 2 (Bunting et al., 2003; Burnouf et al., 2004; Георгеску и др., 2008). Большинство взаимодействий между пептидом и связывающим карманом являются гидрофобными. Однако существует несколько боковых цепей β-зажима, которые образуют ионные контакты с пептидным лигандом, а также несколько амидов основной цепи и карбоксильных атомов кислорода, которые образуют водородные связи с пептидом. Пример линейного пептида в связывающем кармане показан на рисунке 2A [PDBID: 4K30 (Zhao et al., 2013)]. Эта структура содержит пептидную последовательность Ac-QADLF, но ясно, что связывающий карман также может вмещать более канонический L ₂ в гидрофобном кармане на субсайте 2.Многие бактериальные белки связываются с β-зажимом в CBD посредством аналогичных взаимодействий.

Рисунок 2 . Подробная информация о сайте связывания пептида на β-зажиме. Поверхностные остатки в подсайте 1 окрашены в оранжевый цвет, а в подсайт 2 — в голубой. Белые метки остатков относятся к пептиду CBM, а черные метки — остатки сайта связывания β-зажима. (A) Поверхностное изображение кармана связывания пептида и фигурка пептида AcQADLF, связанного с β-зажимом E. coli [PDBID: 4K3O (Zhao et al., 2013)]. (B) Поверхностное представление кармана связывания пептида β-Clamp E. coli с модифицированным пептидным конкурентным ингибитором, Ac-Q ₁ Cha ₂ D ₃ L ₄ (3,4) ClF ₅ связывается в пептидном кармане [PDBID: 3Q4L (Wolff et al., 2011)]. Молекулярный рендеринг был сделан с использованием Chimera (Pettersen et al., 2004).

Пептиды как ингибиторы β-зажима

Пептиды с С-конца δ-субъединицы Pol III, которые связываются с β-зажимом, эффективно конкурируют со связыванием интактной δ-субъединицы (Yin et al., 2013). Пептиды синтезируются с использованием известных химических методов, и как лекарства могут иметь низкую токсичность и хорошую эффективность, однако они часто быстро метаболизируются. Было показано, что эту проблему можно преодолеть путем конъюгирования жирной кислоты с боковой цепью аминокислоты короткого пептида. Жирная кислота является лигандом для стабильных белков сыворотки крови, таких как альбумин, и когда жирная кислота связывается с альбумином, она помогает защитить пептид-лекарство, циркулирующее в организме. Эти новые растворимые «химерные лиганды» прочно связываются с человеческим альбумином (K _D ~ 40 нМ) и могут быть присоединены к пептидным лекарствам с использованием стандартного синтеза (Zorzi et al., 2017).

Было разработано несколько ингибиторов β-зажима, представляющих собой модифицированные пептиды CBM. Цель состояла в том, чтобы сохранить структуру канонического пептидного остова в связывающем кармане, одновременно увеличивая сродство к β-Clamp за счет изменения боковых цепей с другими фрагментами и неприродными аминокислотами. Обычно используемой модификацией является ацетилирование Q ₁ (с образованием Ac-Q ₁ L ₂ D ₃ L ₄ F ₅ ), которое улучшает связывание примерно в 30 раз по сравнению с не -ацетилированный пептид из-за образования водородной связи с остатком аргинина в субсайте 2 (Yin et al., 2013). Когда F ₅ заменяется 3,4-дихлорфениаланином, полученный Ac-Q ₁ L ₂ D ₃ L ₄ (3,4) ClF ₅ пептид связывается с в три раза более высокой сродство (Таблица 1) благодаря улучшенным гидрофобным и ван-дер-ваальским контактам галогеновых групп с субсайтом 1. Комбинация замен Ac-Q ₁ и (3,4) ClF ₅ дает в 110 раз более плотную связывание этого модифицированного ингибитора пента-пептида (Wijffels et al., 2011).

Таблица 1 . Константы ингибирования лигандов β-Clamp ^{a, b, c} .

Другой пример дизайна ингибитора β-зажима на основе нативного пептида, начатого с пептида полимеразы IV CBM, R ₀ Q ₁ L ₂ V ₃ L ₄ G ₅ L ₆ (называется P1). Первыми пептидными модификациями были ацетилирование Q ₁ (описано выше) и использование консенсусного пептида (P6), который улучшал аффинность к β-зажиму.Модификация L ₂ до остатка циклогексил-L-аланил (Cha) и F ₅ до 3,4-дихлорфенилаланина улучшила связывание еще в 15 раз (Wolff et al., 2011). В целом, этот модифицированный пептидный ингибитор, Ac-Q ₁ Cha ₂ D ₃ L ₄ (3,4) ClF ₅ (называемый P14), связывается в 100 раз сильнее, чем нативный P1 (Таблица 1 ). Структура P14, связанного с β-зажимом (рис. 2B), показывает, что скелет находится в конформации, аналогичной нативному пептиду (Wolff et al., 2011). Более сильное сродство достигается за счет того, что остаток Cha распространяется дальше в гидрофобный карман и обеспечивает дополнительные взаимодействия на участке 1. Помимо более сильных гидрофобных контактов с галогензамещенным фенилаланином, мета-хлор образует галогеновую связь с гидроксильным кислородом треонина, обеспечивая дальнейшее усиленное связывание (Wolff et al., 2011).

Малые молекулы как ингибиторы β-зажима

Один из первых зарегистрированных ингибиторов β-зажима был идентифицирован с помощью скрининга библиотеки для соединений, которые ингибировали синтез ДНК in vitro с помощью Pol III и конкурировали за связывание с β-зажимом.Это соединение, называемое RU7, содержит дибромированное ароматическое кольцо, а также оказывает различное ингибирующее действие на Pol II, Pol III и Pol IV. Структура комплекса RU7-β-Clamp показывает, что RU7 связан с субсайтом 1 в сайте связывания, но имеет меньше общих контактов с карманом, чем нативный пептид CBM (Georgescu et al., 2008). Другой низкомолекулярный ингибитор, который был идентифицирован при скрининге in silico трипептидного мотива D ₃ L ₄ F ₅ , представляет собой пептид-миметик бифенилоксимового эфира, названный «соединением 4» (таблица 1) (Wijffels et al. al., 2011). Другой набор ингибиторов был разработан с использованием структурного скрининга фрагментов и других методов in silico . Образующийся свинец, называемый «соединением 8», представляет собой тетрагидрокарбазол и подавляет как грамотрицательные, так и грамположительные бактерии (таблица 1). Повышение эффективности было достигнуто за счет увеличения количества контактов в субпункте 1 β-зажима (Yin et al., 2014a).

Натуральный продукт как ингибитор β-зажима

Гризелимицин (GM) — это натуральный продукт бактериального происхождения, выделенный из Streptomyces и обладающий антибактериальной активностью против Mycobacteria .GM представляет собой частично циклический пептид с последовательностью V ₁ P ₂ T ₃ L ₄ P ₅ L ₆ V ₇ P ₈ L ₉ G ₁₀ где циклизация находится между T3 и G10. Первоначально он не был полностью разработан в лекарственный препарат из-за короткого периода полураспада при пероральном приеме, но был пересмотрен, чтобы обратиться к лекарственно-устойчивым штаммам Mycobacterium tuberculosis (Kling et al., 2015). Эксперименты по профилированию метаболической стабильности природных аналогов показали, что восьмой остаток в GM, пролин, является местом метаболической деградации и причиной нестабильности.Две модификации Pro ₈ у атома Cδ на GM сделали его более устойчивым к деградации, не влияя на аффинность связывания: одна представляет собой добавление метильной группы, приводящей к methyGM, а другая представляет собой циклогексанильную группу, образуя cyclohexylGM (CGM) . Кристаллическая структура CGM, связанного с β-зажимом M. tuberculosis , показала, что он связывается в сайте взаимодействия пептида CBM, ингибирует взаимодействие β-Clamp с субъединицей Pol III δ и также может приводить к снижению процессивности полимеразы.Большинство взаимодействий между CGM и β-зажимом являются гидрофобными, только с двумя водородными связями. Интересно, что низкая частота устойчивости к ГМ была обнаружена у M. tuberculosis и Mycobacterium smegmatis , что было связано с повышением регуляции нескольких генов. Один из этих генов — ген, кодирующий β-Clamp, ген dnaN . Было обнаружено, что сверхэкспрессия гена dnaN при низкочастотной резистентности обусловлена ​​точечной мутацией в промоторе dnaN , приводящей к повышенному уровню β-зажима (Kling et al., 2015). Это говорит о том, что устойчивость микобактерий к ГМ опосредована сверхэкспрессией β-зажима.

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) как ингибиторы β-Clamp

Некоторые нестероидные противовоспалительные препараты подавляли β-зажим Escherichia coli Pol III (Yin et al., 2014b). Анализ с использованием минимальных компонентов (β-зажим, комплекс зажим-загрузчик, α-субъединица Pol III и одноцепочечный связывающий белок) показал, что ингибирование опосредованных β-зажимом взаимодействий этими НПВП напрямую влияет на E.coli Репликация ДНК in vitro . Кристаллические структуры трех комплексов NSAID-β-Clamp показали, что карпрофен, бромфенак и ведапрофен связываются с субсайтом 1 на β-Clamp. Эти молекулы погружают гидрофобную группу в подсайт 1 и ароматическую группу в прилегающую область. Отсутствие взаимодействия с субсайтом 2, вероятно, является причиной относительно слабого взаимодействия с β-зажимом (минимальная ингибирующая концентрация, МИК> 1250 мкМ) и относительно слабого ингибирования по сравнению с такими антибиотиками, как ампициллин (МИК = 125 мкМ) и хлорамфеникол ( MIC = 1.37 мкМ). Тем не менее, эти результаты позволяют предположить, что НПВП могут быть использованы в качестве многообещающей отправной точки для разработки новых антибиотиков (Yin et al., 2014b).

Рекомендации по лечению β-зажима

Различные лиганды, которые связываются в сайте взаимодействия белок-белок на β-clip, обсуждались выше. Хотя консенсусная последовательность была идентифицирована, CBM различных бактериальных белков имеют несколько разные последовательности и количество остатков [например, см .: (Patoli et al., 2013)]. Общая структура β-зажима не изменяется во многих из этих событий связывания, поскольку среднеквадратичное отклонение (среднеквадратичное отклонение) между связанными и свободными от лиганда структурами составляет от 1 до 3 Å. Однако есть локальные изменения в кармане связывания β-зажима для размещения лиганда. В β-зажиме E. coli происходит вращение боковых цепей M ₃₆₂ и S ₃₄₆ , что открывает путь между субсайтами 1 и 2 при связывании лиганда. Кроме того, боковая цепь β-зажима R ₃₆₅ сдвигает положение и открывает гидрофобную платформу для канонического остатка L ₃ (Wijffels et al., 2011). Любые эффективные ингибиторы, предназначенные для этого кармана, должны взаимодействовать с обоими подсайтами.

В дополнение к разработке ингибиторов, которые имеют более высокое сродство, чем природный лиганд, для определения спектра активности лекарственного средства важна специфичность лекарственного средства к его молекулярной мишени, а также к видам бактерий. Например, были обнаружены различия между аналогами ГМ и их взаимодействием с разными штаммами Mycobacteria . GM также имеет более низкое связывание с E.coli β-Clamp и не взаимодействует с эукариотическими PCNA (Kling et al., 2015). Эти результаты предполагают, что возможно нацелить лекарства на отдельный бактериальный штамм. Исследование, оценивающее различные способы связывания пептидов с β-зажимами у разных бактерий, показало, что существуют различия в термодинамике связывания пептидов с их родственными зажимами, и что небольшие модификации могут сильно повлиять на сродство (Wolff et al., 2014 ). Разработка нового успешного антибактериального препарата, вероятно, потребует комбинации нескольких подходов, в том числе рассмотренных выше.

Ядерный антиген пролиферирующих клеток (PCNA)

PCNA представляет собой гомотримерный белок с массой ~ 86 кДа. Два домена в каждом мономере соединены гибкой петлей, называемой IDCL, как в β-зажиме. Последовательность PIP взаимодействует с гидрофобным карманом на передней поверхности белка PCNA рядом с IDCL (Gulbis et al., 1996) (рис. 1B). Карман связывания пептида PIP на PCNA состоит из кармана «Q», в котором образуются водородные связи между консервативной боковой цепью Q и остатками PCNA, за которым затем следует гидрофобный участок (рис. 3A).Пептиды PIP обычно образуют один виток спирали 3–10, которая начинается с четвертого гидрофобного остатка и помещает этот остаток рядом с двумя последними гидрофобными ароматическими остатками (7 и 8). Эти три остатка помещаются в гидрофобный карман в ориентации, напоминающей пробку, как показано для белка FEN-1, взаимодействующего с PCNA (Bruning and Shamoo, 2004) (рис. 3A). Большинство этих взаимодействий законсервированы среди пептидов и белков PIP, которые связываются с PCNA.

Рисунок 3 .Подробная информация о сайте связывания на PCNA, показывающая взаимодействия лигандов. (A) Поверхностное представление пептида FEN-1, связанного с PCNA человека [PDBID: 1U7B (Bruning and Shamoo, 2004)]. Белые метки остатков относятся к пептиду FEN-1, а черные метки указывают на остатки сайта связывания PCNA. (B) Поверхностное представление кармана связывания PIP моноубиквитинированной PCNA человека с низкомолекулярным ингибитором, связанным с T2AA [PDBID: 3WGW (Inoue et al., 2014)]. Этот ингибитор связывает 2: 1 с PCNA со вторым сайтом связывания на границе раздела между субъединицами (детали не показаны).Молекулярный рендеринг был сделан с использованием Chimera (Pettersen et al., 2004).

PCNA был первоначально идентифицирован как ядерный антиген в высокопролиферирующих клетках, отсюда и название ядерный антиген пролиферативных клеток (Miyachi et al., 1978; Bravo and Celis, 1980). Следовательно, PCNA является мишенью для разработки антипролиферативных и противораковых препаратов. При лечении рака химиотерапия может быть генотоксичной как для нормальных, так и для раковых клеток. За счет целенаправленного воздействия на пролиферативные раковые клетки токсичность этих методов лечения снижается.Выполняя свою роль в синтезе транслезии, PCNA посттрансляционно модифицируется (Wang, 2014) и не ассоциируется с хроматином. Возможно, что разработка терапевтических средств для этих модифицированных молекул PCNA приведет к более специфическому нацеливанию на больные клетки. Многие ингибиторы PCNA связываются на сайте PIP и препятствуют связыванию других белков-партнеров, тем самым подавляя репликацию ДНК. Однако не все ингибиторы PCNA связываются в кармане PIP. Было показано, что один из низкомолекулярных ингибиторов, названный PCNA-I1, вместо этого связывается с поверхностью раздела между мономерами PCNA, что приводит к снижению связывания PCNA с хроматином (Tan et al., 2012).

Пептиды как ингибиторы PCNA

Функция

PCNA и ее взаимодействие с APIM важны во время клеточного стресса, поскольку они играют роль в восстановлении поврежденной ДНК. Следовательно, ингибирование этого взаимодействия может влиять на выживание клеток, подвергающихся стрессу, вызванному химиотерапевтическими препаратами (Gederaas et al., 2014). Сверхэкспрессия пептидов, содержащих APIM, вызывает гиперчувствительность раковых клеток к различным химиотерапевтическим средствам. ATX-101 представляет собой APIM-содержащий пептид, проникающий в клетки (Muller et al., 2013) и было показано, что он увеличивает противораковую эффективность препарата митомицин C, который создает межцепочечные перекрестные связи в ДНК, а также с блеомицином и гемцитабином в клетках рака мочевого пузыря (Gederaas et al., 2014). Точно так же ATX-101 индуцировал быстрый каспазозависимый апоптоз и увеличивал цитотоксический эффект мелфалана в течение нескольких дней в клетках множественной миеломы. Обработка ATX-101 индуцировала апоптоз во всех фазах клеточного цикла. Это отличается от активности двух низкомолекулярных ингибиторов PCNA роста раковых клеток, которые разрушают PCNA во время репликации, T2AA и PCNA-I1 (Punchihewa et al., 2012; Tan et al., 2012), и полагаются на высокую скорость пролиферации этих клеток (Muller et al., 2013; Choe and Moldovan, 2016).

Другой модифицированный пептид, связывающий PCNA, показал себя многообещающим при раке груди. Анализ ткани рака молочной железы показал повышенную экспрессию PCNA по сравнению с соседней нормальной тканью, и этот тип рака также коррелировал с более короткой выживаемостью (Smith et al., 2015). Репликация ДНК в клеточных линиях злокачественного рака груди и опухолевой ткани более подвержена ошибкам, чем в незлокачественной ткани (Sekowski et al., 1998). В этих клетках была идентифицирована уникальная форма PCNA, называемая PCNA, связанная с раком (caPCNA), которая отличается от PCNA в нормальных клетках молочной железы из-за посттрансляционной модификации, в частности, метилэстерификации остатков глутаминовой и аспарагиновой кислот (Hoelz et al. , 2006). Используя поликлональное антитело, которое специфически распознает изоформу caPCNA, была идентифицирована пептидная последовательность, названная R9-cc-caPeptide (cc является линкером от R9 к caPeptide), и была синтезирована для имитации этой области.Девять аргининов (R9) были добавлены для облегчения поглощения через клеточную мембрану. Разработанная пептидная часть последовательности, caPeptide, соответствует остаткам 126–133 PCNA, которая является частью IDCL. Капептид ингибирует белки, которые связываются с PCNA, которые необходимы для репликации и репарации ДНК, что в конечном итоге приводит к гибели клеток. R9-cc-caPeptide был цитотоксичным по отношению к нескольким линиям клеток рака груди, а также к раку поджелудочной железы и лимфоме. Поскольку R9-cc-caPeptide специфичен для PCNA, связанной с раком, он нацелен на клетки, содержащие только эту изоформу, и, таким образом, оказывает меньшее влияние на нормальные клетки (Smith et al., 2015).

Маленькая молекула как ингибитор PCNA

T2AA — это низкомолекулярный аналог трийодтиронина (T3), который ингибирует транс-поврежденный синтез ДНК (Punchihewa et al., 2012). Было обнаружено, что T2AA ингибирует взаимодействие PCNA с p21 и Polδ путем связывания в сайте PIP (рис. 3B). Из кристаллической структуры было обнаружено, что две молекулы T2AA связываются с каждым мономером PCNA, а вторая молекула связывается на границе раздела между субъединицами тримера около K ₁₆₄ (Inoue et al., 2014). Этот остаток лизина является известным сайтом моноубиквитинирования, которое является ключевым фактором в регуляции реакции клеток на повреждение ДНК (более подробно обсуждается в Choe and Moldovan, 2016). Сообщалось, что T2AA ингибирует белок-белковые взаимодействия между моноубиквитинированным PCNA и фрагментом polη, содержащим PIP-бокс. Межцепочечные сшивки ДНК восстанавливаются с помощью TLS и моноубиквитинированной PCNA. Клетки, обработанные T2AA, а также цисплатином для лечения рака, показали более низкую выживаемость и увеличение количества двухцепочечных разрывов из-за цисплатина.Таким образом, возможно, что моноубиквитинированная PCNA может быть лекарственной мишенью для химиосенсибилизации с помощью терапевтических средств против рака (Inoue et al., 2014).

ДНК-аптамер, который ингибирует ДНК-полимеразу δ и ε

Еще одно направление разработки противораковых препаратов — использование аптамеров нуклеиновых кислот. Короткий ДНК-аптамер, называемый α-PCNA, был разработан специально для связывания человеческой PCNA, которая ингибирует Polδ и Polε при наномолярных концентрациях in vitro (Kowalska et al., 2018). Аптамер α-PCNA сам принимает конформацию спиральной ДНК β-формы, но демонстрирует некоторые вторичные структурные изменения при связывании с PCNA. Сам белок PCNA не изменяет конформацию при связывании α-PCNA. Было высказано предположение, что комплекс α-PCNA-аптамер-PCNA-ДНК-полимераза недоступен для соединения праймер-матрица на отстающей цепи (Kowalska et al., 2018). Если гипотеза верна, то это уникальный механизм ингибирования зависимых от PCNA функций и имеет потенциал для будущей противораковой терапии.

Нацеливание на PCNA в противовоспалительном лечении

Менее изученная функция PCNA — это его функция при воспалительных заболеваниях через роль, которую он играет в выживании нейтрофилов. Зрелые нейтрофилы — это непролиферирующие клетки, а PCNA обнаруживается в цитозоле. При этом задействованный механизм не совсем понятен, но было показано, что PCNA связывается с несколькими прокаспазами, предотвращая их активацию и ингибируя апоптоз (Dibbert et al., 1999; Witko-Sarsat et al., 2010).Одной из характеристик муковисцидоза является интенсивное воспаление легких, в которое вовлечены нейтрофилы (Chiara et al., 2012). У нейтрофилов пациентов с этим заболеванием наблюдается замедленный апоптоз. Как инфекционное заболевание, лечение муковисцидоза легких включает применение антибиотиков и муколитиков, но это лечение часто малоэффективно (Pier, 2012). Противовоспалительные препараты несколько замедляют прогрессирование заболевания. С-концевой пептид p21, который содержит мотив PIP и связывается с сайтом PIP на PCNA, также вызывает апоптоз нейтрофилов и последующий распад PCNA (Witko-Sarsat et al., 2010). Было высказано предположение, что нацеливание на PCNA для модуляции апоптоза замедленных нейтрофилов в сочетании с противовоспалительной и противоинфекционной терапией может быть полезным, но требует дополнительных разработок и исследований (Chiara et al., 2012).

Соображения по поводу терапевтических средств, нацеленных на PCNA

PCNA человека представляет собой очень стабильную структуру, которая не сильно меняется при связывании лигандов PIP или APIM, поскольку эти структуры практически совмещаются с лигандами или без них. Среднеквадратичное значение. между атомами Cα составляет <1 Å для связанных и несвязанных структур (Bruning and Shamoo, 2004).Поскольку IDCL взаимодействует с пептидами PIP, его структура варьируется в зависимости от пептидов в кармане. Большинство ингибиторов PCNA, которые, как сообщается, связываются на сайте PIP, не влияют на структуру PCNA. Небольшой белок, который может разорвать тримерное кольцо PCNA, был обнаружен в архее Thermococcus kodakarensis (Li et al., 2014). Белок, называемый TIP, содержит неканонический мотив PIP, за которым следует амфипатическая спираль из 17 остатков, которая связывается на поверхности PCNA рядом с IDCL.Структурный эффект связывания TIP с отдельными доменами PCNA невелик, но его достаточно, чтобы разрушить тримерную структуру PCNA (Altieri et al., 2016). Неизвестно, экспрессируется ли подобный белок у эукарии. PCNA экспрессируется во всех клетках, поэтому ингибиторы PCNA могут быть токсичными не только для злокачественных, но и для здоровых клеток. Нацеливание на цитозольный PCNA или конкретные варианты PCNA, вероятно, будет более успешным в качестве терапевтического средства. В своем обзоре де Марч и де Биайзио (De March и De Biaisio, 2017) обсуждают структурные детали своей работы над внутренней скользящей поверхностью PCNA и предполагают, что нацеливание на эти взаимодействия имеет потенциал для новых терапевтических средств.Нацеливание на PCNA в его роли в репарации ДНК и посттрансляционной передаче сигналов, вероятно, повысит специфичность в отношении клеток, участвующих в болезненных состояниях (Wang, 2014). PCNA посттрансляционно модифицируется за счет убиквитинирования, сумоилирования, ацетилирования и фосфорилирования, среди прочего, и эти модификации могут использоваться в качестве мишеней для лекарств. PCNA реагирует на повреждение ДНК, обеспечивая безошибочный путь, поэтому добавление ингибиторов, предназначенных для воздействия на модифицированные PCNA, можно использовать в сочетании с противораковыми терапевтическими средствами (Zhu et al., 2014).

Заключительные замечания

Скользящие зажимы для ДНК необходимы для жизнеспособности клеток и, следовательно, являются мишенями для противоопухолевых и антибактериальных препаратов. Хотя сообщалось о нескольких пептидах и небольших молекулах, которые ингибируют скользящие зажимы, на сегодняшний день ни один из них не поступил в клинику. Одна из основных проблем с ингибиторами PCNA — потенциальная токсичность для здоровых клеток из-за отсутствия специфичности для злокачественных клеток. В будущих исследованиях могут быть выявлены новые механизмы, позволяющие направлять лекарства только на злокачественные клетки (т.(например, конъюгаты антитело-лекарственное средство или посттрансляционные модификации PCNA при репарации ДНК). Работа по ингибированию бактериальных β-зажимов предоставила более подробную информацию и очень многообещающая для разработки новых антибактериальных препаратов. Хотя общие структуры PCNA и β-зажимов схожи, их аминокислотные последовательности и сайты связывания существенно различаются. Таким образом, ингибиторы, которые связывают бактериальные зажимы, вряд ли влияют на функцию PCNA эукариот. Хотя обобщенные здесь исследования продвинули нас вперед в ингибировании зажима ДНК и разработке новых антибактериальных и противораковых терапевтических средств, будущая работа по лучшему пониманию конкретных механизмов, лежащих в основе этих взаимодействий и связанных с ними процессов, обеспечит столь необходимое понимание.Ясно, что фундаментальные исследования структуры и связывания терапевтических препаратов с PCNA и β-clip привели к многообещающим достижениям в области инфекционных заболеваний и рака. Дальнейшая работа по лучшему пониманию конкретных механизмов, лежащих в основе взаимодействий и связанных процессов скользящих зажимов, обещает предоставить важные приложения.

Авторские взносы

AA изучил литературу, резюмировал результаты и написал статью. ZK предложил тему обзора и написал статью.

Финансирование

Эта работа была поддержана Национальным институтом стандартов и технологий.

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Сокращения

PCNA, ядерный антиген пролиферирующих клеток; RFC, фактор репликации C; FEN-1, эндонуклеаза лоскута 1; Polδ, ДНК-полимераза δ; Polε, ДНК-полимераза ε; Pol III, бактериальная ДНК-полимераза III; PIP, взаимодействующий с PCNA пептид; APIM, мотив, взаимодействующий с PCNA, гомолог 2 AlkB; CBM, мотив связывания β-зажима; IDCL, петля междоменного коннектора; Cha, циклогексилаланин; GM, гризелимицин; CGM, Pro-8-циклогексил гризелимицин; НПВП, нестероидные противовоспалительные препараты; МИК — минимальная ингибирующая концентрация; caPCNA, PCNA, ассоциированная с раком; α-PCNA, ДНК-аптамер PCNA; TIP, Thermococcales ингибитор PCNA.

Список литературы

Альтьери, А.С., Ладнер, Дж. Э., Ли, З., Робинсон, Х., Саллман, З. Ф., Марино, Дж. П. и др. (2016). Небольшой белок подавляет ядерный антиген пролиферирующих клеток, разрушая зажим ДНК. Nucleic Acids Res. 44, 6232–6241. DOI: 10.1093 / nar / gkw351

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Брук, И., и О’Доннелл, М. (2001). Семейство скользящих зажимов из полимеразы кольцевого типа. Genome Biol. 2: обзоры3001.1-обзоры3001.3.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Брюнинг, Дж. Б., и Шаму, Ю. (2004). Структурный и термодинамический анализ человеческого PCNA с пептидами, полученными из субъединицы p66 ДНК-полимеразы-δ и эндонуклеазы-1 лоскута. Строение 12, 2209–2219. DOI: 10.1016 / j.str.2004.09.018

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бантинг, К. А., Роу, С. М., и Перл, Л. Х. (2003). Структурная основа для привлечения транслезионной ДНК-полимеразы Pol IV / DinB к бета-зажиму. Embo J. 22, 5883–5892. DOI: 10.1093 / emboj / cdg568

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бурноуф Д. Ю., Олиерик В., Вагнер Дж., Фуджи С., Рейнболт Дж., Фукс Р. П. и др. (2004). Структурный и биохимический анализ взаимодействий скользящего зажима / лиганда указывает на конкуренцию между репликативными и транслезионными ДНК-полимеразами. J. Mol. Биол. 335, 1187–1197. DOI: 10.1016 / j.jmb.2003.11.049

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кьяра, А.Д., Педерзоли-Рибейл, М., Бургель, П. Р., Данел, К., и Витко-Сарсат, В. (2012). Нацеливание на ядерный антиген цитозольных пролиферирующих клеток при воспалении с преобладанием нейтрофилов. Фронт. Иммунол. 3: 311. DOI: 10.3389 / fimmu.2012.00311

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чой К.Н., Молдован Г.-Л. (2016). Продвигаясь сквозь тьму: PCNA, по-прежнему главный проводник репликационной вилки. Мол. Cell 65, 380–392. DOI: 10.1016 / j.molcel.2016.12.020

CrossRef Полный текст

Далримпл, Б. П., Конгсуван, К., Вейффельс, Г., Диксон, Н. Э. и Дженнингс, П. А. (2001). Универсальный мотив межбелкового взаимодействия в системах репликации и репарации ДНК эубактерий. Proc. Natl. Акад. Sci. США 98, 11627–11632. DOI: 10.1073 / pnas.1

398

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Де Марч, М., Де Бьезио, А. (2017). Темная сторона кольца: роль скользящей поверхности ДНК PCNA .Крит. Rev. Biochem. Мол. Биол . 52, 663–673. DOI: 10.1080 / 10409238.2017.1364218

CrossRef Полный текст

Дибберт Б., Вебер М., Николайзик В. Х., Фогт П., Шони М. Х., Блазер К. и др. (1999). Цитокин-опосредованный дефицит Bax и последующий отсроченный апоптоз нейтрофилов: общий механизм накопления эффекторных клеток при воспалении. Proc. Natl. Акад. Sci. США 96, 13330–13335. DOI: 10.1073 / pnas.96.23.13330

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Флорес-Розас, Х., Кельман, З., Дин, Ф. Б., Пан, З. К., Харпер, Дж. У., Элледж, С. Дж. И др. (1994). Cdk-взаимодействующий белок 1 напрямую связывается с ядерным антигеном пролиферирующих клеток и ингибирует репликацию ДНК, катализируемую холоферментом ДНК-полимеразы d. Proc. Natl. Акад. Sci. США 91, 8655–8659. DOI: 10.1073 / pnas.91.18.8655

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гедераас, О. А., Согаард, К. Д., Висет, Т., Бачке, С., Брюхейм, П., Арум, К. Дж. И др. (2014). Повышение противоопухолевой эффективности внутрипузырной терапии митомицином С в сочетании с целевым пептидом PCNA. Пер. Онкол. 7, 812–823. DOI: 10.1016 / j.tranon.2014.10.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Георгеску, Р. Э., Юрьева, О., Ким, С. С., Куриан, Дж., Конг, X. П., и О’Доннелл, М. (2008). Структура низкомолекулярного ингибитора скользящего зажима ДНК-полимеразы. Proc. Natl. Акад. Sci. США 105, 11116–11121. DOI: 10.1073 / pnas.0804754105

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гиббс, Э., Кельман, З., Гулбис, Дж. М., О’Доннелл, М., Куриан, Дж., Бюргерс, П. М. Дж. И др. (1997). Влияние ядерного антиген-взаимодействующего домена пролиферирующих клеток p21 ^{CIP 1} на синтез ДНК, катализируемый холоферментами δ-полимеразы Saccharomyces человека и Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 272, 2373–2381.

Google Scholar

Гилджам, К. М., Фейзи, Э., Аас, П. А., Соуза, М. М., Мюллер, Р., Вагбо, К. Б. и др. (2009). Идентификация нового, широко распространенного и функционально важного мотива связывания PCNA. J. Cell Biol. 186, 645–654. DOI: 10.1083 / jcb.2008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гулбис, Дж. М., Кельман, З., Гурвиц, Дж., О’Доннелл, М., и Куриан, Дж. (1996). Структура C-концевой области p21 ^{WAF1 / CIP1} в комплексе с PCNA человека. Cell 87, 297–306. DOI: 10.1016 / S0092-8674 (00) 81347-1

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хельц, Д. Дж., Арнольд, Р. Дж., Добролецки, Л.Э., Абдель-Азиз В., Лёрер А. П., Новотны М. В. и др. (2006). Открытие лабильных метиловых эфиров на ядерном антигене пролиферирующих клеток методом МС / МС. Proteomics 6, 4808–4816. DOI: 10.1002 / pmic.200600142

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Иноуэ А., Кикучи С., Хишики А., Шао Ю., Хит Р., Эвисон Б. Дж. И др. (2014). Низкомолекулярный ингибитор моноубиквитинированного ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) ингибирует восстановление межцепочечных сшивок ДНК, усиливает двухцепочечный разрыв ДНК и сенсибилизирует раковые клетки к цисплатину. J. Biol. Chem. 289, 7109–7120. DOI: 10.1074 / jbc.M113.520429

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кельман, З., и О’Доннелл, М. (1995). Структурное и функциональное сходство скользящих зажимов прокариотической и эукариотической ДНК-полимеразы. Nucleic Acids Res. 23, 3613–3620. DOI: 10.1093 / nar / 23.18.3613

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Клинг, А., Лукат, П., Алмейда, Д. В., Бауэр, А., Fontaine, E., Sordello, S., et al. (2015). Антибиотики. Ориентация на DnaN для лечения туберкулеза с использованием новых гризелимицинов. Наука 348, 1106–1112. DOI: 10.1126 / science.aaa4690

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Конг, X. П., Онраст, Р., О’Доннелл, М., и Куриан, Дж. (1992). Трехмерная структура субъединицы β холофермента ДНК-полимеразы III E. coli : скользящий зажим ДНК. Cell 69, 425–437.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Контопидис, Г., Wu, S.Y., Zheleva, D.I., Taylor, P., McInnes, C., Lane, D.P., et al. (2005). Структурные и биохимические исследования ядерных антигенных комплексов пролиферирующих клеток человека дают обоснование для ассоциации циклинов и дизайна ингибиторов. Proc. Natl. Акад. Sci. США 102, 1871–1876. DOI: 10.1073 / pnas.0406540102

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ковальска Э., Бартницки Ф., Фудзисава Р., Бонарек П., Херманович П., Цуримото Т. и др.(2018). Ингибирование репликации ДНК комплексом аптамер анти-PCNA / PCNA. Nucleic Acids Res. 46, 25–41. DOI: 10.1093 / nar / gkx1184

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Li, Z., Huang, R.Y., Yopp, D.C., Hileman, T.H., Santangelo, T.J., Hurwitz, J., et al. (2014). Новый механизм регулирования активности ядерного антигена пролиферирующих клеток с помощью небольшого белка. Nucleic Acids Res. 42, 5776–5789. DOI: 10.1093 / nar / gku239

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Миячи, К., Фрицлер, М. Дж., И Тан, Э. М. (1978). Аутоантитела к ядерному антигену в пролиферирующих клетках. J. Immun. 121, 2228–2234.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Muller, R., Misund, K., Holien, T., Bachke, S., Gilljam, K.M, Vatsveen, T. K., et al. (2013). Нацеливание на ядерный антиген пролиферирующих клеток и его белковые взаимодействия индуцирует апоптоз в клетках множественной миеломы. PLoS ONE 8: e70430. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070430

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Патоли, А.А., Винтер Дж. А., Бантинг К. А. (2013). Субъединица UmuC ДНК-полимеразы V E. coli демонстрирует уникальное взаимодействие с фактором процессивности бета-зажима. BMC Struct. Биол. 13:12. DOI: 10.1186 / 1472-6807-13-12

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Петтерсен, Э. Ф., Годдард, Т. Д., Хуанг, К. К., Коуч, Г. С., Гринблатт, Д. М., Менг, Е. С. и др. (2004). UCSF Chimera — система визуализации для поисковых исследований и анализа. Дж.Comput. Chem. 25, 1605–1612. DOI: 10.1002 / jcc.20084

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Punchihewa, C., Inoue, A., Hishiki, A., Fujikawa, Y., Connelly, M., Evison, B., et al. (2012). Идентификация низкомолекулярного ингибитора ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA), который нарушает взаимодействия с белками PIP-бокса и ингибирует репликацию ДНК. J. Biol. Chem. 287, 14289–14300. DOI: 10.1074 / jbc.M112.353201

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Себеста, М., Купер, К. Д., Ариза, А., Карни, К. Дж., И Ахел, Д. (2017). Структурные сведения о функции ZRANB3 в ответе на стресс репликации. Нац. Commun. 8: 15847. DOI: 10.1038 / ncomms15847

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сековски, Дж. У., Малкас, Л. Х., Шнапер, Л., Бектел, П. Э., Лонг, Б. Дж., И Хики, Р. Дж. (1998). Клетки рака груди человека содержат устройство репликации ДНК, подверженное ошибкам. Cancer Res. 58, 3259–3263.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Смит, С. Дж., Гу, Л., Фиппс, Э. А., Добролецки, Л. Е., Мабри, К. С., Галли, П. и др. (2015). Пептид, имитирующий область ядерного антигена пролиферирующих клеток, специфичный для ключевых взаимодействий с белками, является цитотоксичным для рака груди. Мол. Pharmacol. 87, 263–276. DOI: 10.1124 / mol.114.0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Tan, Z., Wortman, M., Dillehay, K. L., Seibel, W.Л., Эвелин, С. Р., Смит, С. Дж. И др. (2012). Низкомолекулярное нацеливание на ассоциацию хроматина с ядерным антигеном пролиферирующих клеток ингибирует рост опухолевых клеток. Мол. Pharmacol. 81, 811–819. DOI: 10.1124 / моль.112.077735

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Wang, S.-C. (2014). PNCA: тихая домработница или потенциальная терапевтическая мишень? Trends Pharmacol. Sci . 35, 178–186. DOI: 10.1016 / j.tips.2014.02.004

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Варбрик, Э., Хезерингтон, В., Лейн, Д. П., и Гловер, Д. М. (1998). PCNA-связывающие белки в Drosophila melanogaster : анализ консервативного связывающего домена PCNA. Nucleic Acids Res. 26, 3925–3932. DOI: 10.1093 / nar / 26.17.3925

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wijffels, G., Johnson, W.M., Oakley, A.J., Turner, K., Epa, V.C., Briscoe, S.J., et al. (2011). Ингибиторы связывания бактериального скользящего зажима по своей конструкции. Дж.Med. Chem. 54, 4831–4838. DOI: 10.1021 / jm2004333

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Витко-Сарсат, В., Мочек, Дж., Буаяд, Д., Тамассия, Н., Рибей, Дж. А., Кандал, К., и др. (2010). Ядерный антиген пролиферирующих клеток действует как цитоплазматическая платформа, контролирующая выживаемость нейтрофилов человека. J. Exp. Med. 207, 2631–2645. DOI: 10.1084 / jem.200

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вольф, П., Амаль, И., Олиерик, В., Чалоин, О., Гигли, Г., Эннифар, Э. и др. (2014). Дифференциальные способы связывания пептидов на репликативных скользящих зажимах из различных бактериальных источников. J. Med. Chem. 57, 7565–7576. DOI: 10.1021 / jm500467a

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Wolff, P., Olieric, V., Briand, J.P., Chaloin, O., Dejaegere, A., Dumas, P., et al. (2011). Конструирование на основе структуры коротких пептидных лигандов, связывающихся с процессивным кольцом E. coli .J. Med. Chem. 54, 4627–4637. DOI: 10.1021 / jm200311m

CrossRef Полный текст

Янг В. и Гао Ю. (2018). Трансформации и репарации ДНК-полимераз; разнообразная конструкция и механизм . Аня. Ред. Biochem . 87, 239–261. DOI: 10.1146 / annurev-biochem-062917-012405

CrossRef Полный текст

Инь, З., Келсо, М. Дж., Бек, Дж. Л., и Окли, А. Дж. (2013). Структурное и термодинамическое рассечение распознавания линейных мотивов с помощью скользящего зажима E. coli .J. Med. Chem. 56, 8665–8673. DOI: 10.1021 / jm401118f

CrossRef Полный текст

Инь, З., Ван, Ю., Уиттел, Л. Р., Джергич, С., Лю, М., Гарри, Э. и др. (2014b). Репликация ДНК является мишенью для антибактериального действия нестероидных противовоспалительных препаратов. Chem. Биол. 21, 481–487. DOI: 10.1016 / j.chembiol.2014.02.009

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Инь, З., Уиттел, Л. Р., Ван, Ю., Джергич, С., Лю, М., Гарри, Э. Дж. И др. (2014a). Открытие соединений-свинцов, нацеленных на бактериальный скользящий зажим, с использованием фрагментарного подхода. J. Med. Chem. 57, 2799–2806. DOI: 10.1021 / jm500122r

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжао, Г., Цзинь, З., Аллевелл, Н. М., Тучман, М., и Ши, Д. (2013). Кристаллическая структура N-ацетилтрансферазного домена человеческой N-ацетил-L-глутаматсинтазы в комплексе с N-ацетил-L-глутаматом позволяет понять его каталитические и регуляторные механизмы. PLoS ONE 8: e70369. DOI: 10.1371 / journal.pone.0070369

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Чжу, К., Чанг, Ю., Ян, Дж., И Вэй, К. (2014). Посттрансляционные модификации ядерного антигена пролиферирующих клеток: ключевой сигнальный интегратор для ответа на повреждение ДНК. Онкол . Lett . 7, 1363–1369. DOI: 10.3892 / ol.2014.1943

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зорзи, А., Миддендорп, С. Дж., Уилбс, Дж., Дейл, К., Хейнис, К. (2017). Ацилированный гептапептид связывает альбумин с высоким сродством, и его применение в качестве метки дает пептиды длительного действия. Нац. Commun. 8: 16092. DOI: 10.1038 / ncomms16092

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

АТФаз с зажимом-загрузчиком и эволюция механизмов репликации ДНК | BMC Biology

Связывание регуляторного домена MutL со скользящим β-зажимом зависит от вида | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

β-Clamp — это белковый узел, центральный для репликации ДНК и управления вилкой. Белки, взаимодействующие с β-Clamp, несут консервативный мотив связывания с зажимом, который часто обнаруживается в протяженных областях. Следовательно, Clamp-взаимодействия изучались почти исключительно с использованием коротких пептидов, воспроизводящих связывающий мотив.Этот подход выявил молекулярные детерминанты, которые опосредуют связывание, но не может описать, как распознаются белки с зажимом-связывающими мотивами, встроенными в структурированные домены. Белок репарации несоответствия MutL имеет внутренний мотив связывания зажима, но его взаимодействие с β-зажимом играет разные роли в зависимости от организма. В Bacillus subtilis взаимодействие стимулирует эндонуклеазную активность MutL и имеет решающее значение для репарации ошибочного спаривания ДНК. Напротив, нарушение взаимодействия между Escherichia coli MutL и β-зажимом вызывает только мягкий мутаторный фенотип.Здесь мы определили структуры регуляторных доменов E. coli и B. subtilis MutL, связанных с их соответствующими β-зажимами. Структуры обнаруживают различные режимы связывания, соответствующие тому, что связывание с β-зажимом является двухступенчатым процессом. Функциональная характеристика указывает на то, что внутри регуляторного домена для взаимодействия между двумя белками требуется только фиксирующий мотив. Однако дополнительные мотивы за пределами регуляторного домена могут стабилизировать взаимодействие.Мы предлагаем модель активации эндонуклеазной активности MutL в организмах, лишенных метил-направленной репарации ошибочного спаривания.

ВВЕДЕНИЕ

Скользящий β-зажим и его эукариотический аналог PCNA представляют собой кольцевые структуры, которые окружают ДНК и привязывают своих партнеров по связыванию к ДНК. Основная роль этих зажимов заключается в увеличении процессивности ДНК-полимеразы, но они также играют критическую роль в регулировании репликации ДНК, переключении полимеразы и репарации несоответствий ДНК (1-4).Инициирование репарации ошибочного спаривания ДНК зависит от скоординированных действий двух белков — MutS и MutL — оба из которых взаимодействуют с β-зажимом (5-7). MutS распознает несовпадения и небольшие петли вставки / делеции, которые избежали проверки ДНК-полимеразой, и рекрутирует MutL для маркировки вновь синтезированной цепи для репарации либо напрямую (метил-независимая репарация), либо косвенно (метил-направленная репарация). Escherichia coli содержит специальную нуклеазу, которая распознает временно гемиметилированную ДНК и разрывает неметилированную цепь, эффективно отличая новую цепь от цепи-матрицы.Однако у большинства прокариот — и у всех эукариот — этот ген отсутствует. Вместо этого гомологи MutL этих организмов обладают собственной нуклеазной активностью, которая стимулируется взаимодействием с β-clamp или его эукариотическим аналогом PCNA (8-11). Соответственно, разрушение клэмп-связывающего мотива в B. subtilis MutL вызывает сильный мутаторный фенотип, тогда как нарушение этого мотива в E. coli MutL, не обладающее нуклеазной активностью, вызывает менее тяжелый мутаторный фенотип (6 , 10).Скользящие зажимы связывают ДНК с определенной ориентацией. Следовательно, белки, взаимодействующие с β-зажимом, также связывают ДНК в определенной ориентации. В случае MutL эта асимметрия определяет разрезанную цепь дуплекса ДНК (12).

Все партнеры по связыванию зажима содержат консервативный линейный мотив, известный как блок PCNA-взаимодействующего белка (PIP) или мотив связывания зажима (CBM), который связывает гидрофобную бороздку на скользящем зажиме (рис. 1А). PIP-боксы имеют строгую консенсусную последовательность QxxLxxFF, где консервативные остатки лейцина и фенилаланина образуют спираль 3 ₁₀ , которая определяет взаимодействие «трехразветвленной вилки» с PCNA (13).На сегодняшний день описан только один PIP-бокс, в котором отсутствуют два ароматических остатка (14), что подчеркивает важность этих двух остатков. Связывающие зажимы мотивы короче и имеют общую консенсусную последовательность QL (D / S) LF (дополнительный рисунок S1). Эта консенсусная последовательность допускает большую вариабельность, чем консенсус PIP-box, функция, которая часто затрудняет идентификацию CBM (15). PIP боксы и CBMs обычно обнаруживаются в гибких концевых областях и, следовательно, большая часть структурной информации поступает из комплексов PCNA или β-clamp, связанных с короткими пептидами, происходящими от партнеров по связыванию (16-19).Эти исследования показали, что все партнеры по связыванию зажима имеют характерное бидентатное взаимодействие, когда консервативные остатки глутамина и лейцина в мотиве связаны с соседними карманами на С-конце β-зажима. Они также показали, как петли, окружающие эти два кармана, являются гибкими и смыкаются, определяя стенки канавки при связывании пептида. Эти исследования, однако, не могут объяснить, как β-clamp приспосабливает множественных партнеров по связыванию или как дополнительные поверхности β-clamp регулируют переключение партнеров (1,2).Исследования с PCNA, связанным с более длинными фрагментами их соответствующих партнеров по связыванию, привели к структурам, которые поддерживают партнеров по связыванию зажима в заблокированных, неактивных конформациях (16, 20, 21), тем самым предоставляя информацию о пептиде-белке и белке-белке. взаимодействия, позволяющие переключаться между партнерами. Однако структурная информация об активных комплексах β-Clamp или PCNA все еще очень ограничена (22).

Рисунок 1.

Стабилизация комплекса зажим-MutL.( A ) Консервация последовательности канонического зажима-связывающего мотива (вверху), MutL-Clamp- и PCNA-связывающего мотива (в центре) и PIP-бокса (внизу). Gln и объемный гидрофобный остаток, консервативный во всех мотивах, выделены фиолетовым. Сохраненные остатки, уникальные для каждого мотива, выделены зеленым, желтым и голубым цветом. ( B ) Ленточное изображение эндонуклеазного домена B. subtilis MutL (433–627). Начало регуляторного домена (RGD) отмечено красной стрелкой.Мотив эндонуклеазы окрашен в пурпурный цвет, а ионы металлического цинка показаны зелеными сферами. Клэмп-связывающий мотив (CBM) окрашен в голубой цвет, а боковые цепи консервативных остатков Gln и Leu показаны в виде полосок. ( C ) Конструирование слияний E. coli и B. subtilis Clamp-MutL ^RGD показано синим и красным соответственно. Номера соответствуют остаткам от каждого белка, включенного в слияние (Ecclamp (1–366), EcMutL ^RGD (471–574), Bsclamp (1–378), BsMutL ^RGD (482–574).( D ) Профили гель-хроматографии слияния E. coli и B. subtilis Clamp-MutL ^RGD . Объемы элюирования эталонных белков: 1. тиреоглобулин (669 кДа), 2. ферритин (440 кДа), 3. каталаза (232 кДа), 4. альдолаза (158 кДа), 5. альбумин (67 кДа), 6. овоальбумин. (43 кДа), 7. Химотрипсиноген А (25 кДа) и 8. Рибонуклеаза А (13,7 кДа). Вертикальными линиями отмечены объемы элюирования Bsclamp (13,1 мл), Ecclamp (13,7 мл), BsMutL ^RGD (17.2 мл) и EcMutL ^RGD (17,3 мл).

Рисунок 1.

Стабилизация комплекса зажим-MutL. ( A ) Консервация последовательности канонического зажима-связывающего мотива (вверху), MutL-Clamp- и PCNA-связывающего мотива (в центре) и PIP-бокса (внизу). Gln и объемный гидрофобный остаток, консервативный во всех мотивах, выделены фиолетовым. Сохраненные остатки, уникальные для каждого мотива, выделены зеленым, желтым и голубым цветом. ( B ) Ленточное изображение эндонуклеазного домена B.subtilis MutL (433–627). Начало регуляторного домена (RGD) отмечено красной стрелкой. Мотив эндонуклеазы окрашен в пурпурный цвет, а ионы металлического цинка показаны зелеными сферами. Клэмп-связывающий мотив (CBM) окрашен в голубой цвет, а боковые цепи консервативных остатков Gln и Leu показаны в виде полосок. ( C ) Конструирование слияний E. coli и B. subtilis Clamp-MutL ^RGD показано синим и красным соответственно. Номера соответствуют остаткам от каждого белка, включенного в слияние (Ecclamp (1–366), EcMutL ^RGD (471–574), Bsclamp (1–378), BsMutL ^RGD (482–574).( D ) Профили гель-хроматографии слияния E. coli и B. subtilis Clamp-MutL ^RGD . Объемы элюирования эталонных белков: 1. тиреоглобулин (669 кДа), 2. ферритин (440 кДа), 3. каталаза (232 кДа), 4. альдолаза (158 кДа), 5. альбумин (67 кДа), 6. овоальбумин. (43 кДа), 7. Химотрипсиноген А (25 кДа) и 8. Рибонуклеаза А (13,7 кДа). Вертикальными линиями отмечены объемы элюирования Bsclamp (13,1 мл), Ecclamp (13,7 мл), BsMutL ^RGD (17.2 мл) и EcMutL ^RGD (17,3 мл).

По сравнению с концевыми CBM, внутренние зажимы-связывающие мотивы в структурированных доменах плохо охарактеризованы. Escherichia coli ДНК-полимераза V (UmuC) имеет внутренний CBM, расположенный между доменами ее мизинца и С-концевым концом, но, поскольку он находится внутри линкера, соединяющего два домена, его взаимодействие с β-зажимом было структурно изучено с использованием короткого пептид (17). Подблоки α-катализатора и ϵ корректора E.coli ДНК-полимераза III также содержит внутренние CBM (23-25). Структурно взаимодействие E. coli Pol IIIα с β-зажимом также было изучено с использованием короткого пептида (18). Следовательно, как и в предыдущих анализах, эти структуры не предоставляют информации о том, как окружающие домены в партнере влияют на его связывание с β-зажимом. Клэмп-связывающий мотив MutL расположен в структурированной области эндонуклеазного домена (26). Хотя зажим-связывающий мотив MutL находится в открытой петле эндонуклеазного домена, связывание с β-зажимом должно вызывать значительные перестройки, чтобы избежать стерических затруднений.Взаимодействие между MutL и скользящим β-зажимом сохраняется от бактерий к человеку (11,26), поэтому один и тот же мотив связывания опосредует взаимодействие с β-зажимом и PCNA (рис. 1A). Чтобы понять, как гомологи MutL взаимодействуют с β-зажимом, мы определили кристаллические структуры β-зажима B. subtilis и E. coli , связанных с регуляторными доменами их соответствующих гомологов MutL. Мы обнаружили, что B. subtilis MutL взаимодействует с β-зажимом посредством характерного бидентатного взаимодействия, тогда как E.coli MutL образует монодентатное взаимодействие. Сравнение двух структур выявляет компромисс между конформационными изменениями в регуляторном домене и образованием бидентатного взаимодействия с β-зажимом. Мы предлагаем модель, описывающую, как конформационные изменения в регуляторном домене B. subtilis MutL при связывании с β-зажимом выравнивают сайт нуклеазы с центральной полостью β-зажима. Эта модель раскрывает роль консервативного мотива GQ, обнаруженного в гомологах MutL с эндонуклеазной активностью.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Дизайн слитых белков Clamp-MutL

Фрагмент остатков 471–574, кодирующих MutL E. coli (регуляторный домен, MutL ^RGD ), был субклонирован в модифицированном векторе экспрессии pET15b, содержащем N-концевую метку His ₆ , удаляемую вирусом травления табака (TEV ) протеазный сайт с использованием сайтов рестрикции BamHI / BlpI (pAG8902). Полноразмерный β-зажим E. coli был впоследствии субклонирован с использованием сайтов рестрикции NdeI / BamHI для создания E.coli слияние Clamp-MutL ^RGD (pAG8903). Сайт рестрикции SalI был сконструирован между двумя фрагментами белка для введения линкера, обогащенного глицином / серином (SGASG). Олигонуклеотиды, кодирующие линкер, фланкированный сайтами SalI / BamHI, были приобретены у Integrated DNA Technologies и лигированы с получением конечной плазмиды слитой экспрессии Clamp-SGASG-MutL ^RGD (pAG8918). Плазмида слитой экспрессии B. subtilis (pAG9021) была получена аналогичным образом и включала полноразмерный β-clip и остатки 482–574 из B.subtilis MutL (MutL ^RGD ), соответствующий его регуляторному домену, к которому присоединен линкер из трех аминокислот (VDS). Идентичность всех плазмид подтверждали секвенированием ДНК (MOBIX, Университет Макмастера).

Экспрессия и очистка белка

Слияния E. coli и B. subtilis Clamp-MutL ^RGD были получены в клетках BL21 (DE3), дополненных плазмидой, кодирующей редкие тРНК. Клетки выращивали в среде LB до OD ₆₀₀ ∼0.7, и экспрессию белка индуцировали добавлением 1,5 мМ изопропил-β-d-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Клетки собирали центрифугированием (1000 × г, в течение 15 мин) после инкубации в течение ночи при 16 ° C. Осадки клеток ресуспендировали в 20 мМ Трис-HCl pH 8, 500 мМ NaCl, 1,4 мМ β-меркаптоэтаноле, 5% глицерине и лизировали обработкой ультразвуком. Лизаты осветляли центрифугированием при 39 000 × g в течение 40 минут. Супернатант наносили на аффинную колонку с хелатирующим никелем (GE Healthcare), предварительно уравновешенную 20 мМ трис-HCl pH 8, 500 мМ NaCl, 1.4 мМ β-меркаптоэтанол, 5% глицерин. Колонку промывали 63 мМ имидазолом и слитые His-tag элюировали 195 мМ имидазолом. Фракции, содержащие белок, были объединены, и концентрация соли была доведена до 150 мМ NaCl перед загрузкой их на ионообменную колонку Q-Sepharose (GE Healthcare), уравновешенную 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1,4 мМ β. -меркаптоэтанол, 5% глицерин. Белок элюировали с колонки, используя линейный градиент до 500 мМ NaCl (слитые соединения Clamp-MutL ^RGD элюируют при ~ 350 мМ NaCl).Белок дополнительно очищали с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием эксклюзионной колонки Superdex200 (S200) 10/300 GL (GE Healthcare), уравновешенной 20 мМ трис-HCl pH 7,5, 150 мМ NaCl, 1,4 мМ β-меркаптоэтанола, 5% глицерина. . Элюированные образцы концентрировали до 20 мг / мл, и концентрацию белка рассчитывали с использованием уравнения Бера-Ламберта с коэффициентом экстинкции 29 450 M ^-1 см ^-1 и 24 710 M ^-1 см ^-1. для E.coli и B. subtilis слияния Clamp-MutL ^RGD соответственно.

Кристаллизация и определение структуры

Кристаллы слияния E. coli Clamp-MutL ^RGD росли в 100 мМ Bis-Tris pH 5,5 и 2 М сульфате аммония и подвергались криозащите путем добавления 8% глицерина к маточному раствору. Кристаллы слияния B. subtilis Clamp-MutL ^RGD росли в 100 мМ HEPES pH 7,5, 25% PEG 3350 (об. / Об.) И 0.2 М сульфата аммония и подвергали криозащите путем добавления 12% этиленгликоля. Полные наборы данных были собраны на лучевых линиях O8ID-1 и O8B1-1 канадского источника света и обработаны с помощью XDS (таблица 1) (27). Структуры были определены путем молекулярной замены с использованием структур отдельных компонентов в качестве моделей поиска (PDB: 4K3M и 1X9Z для слияния E. coli и PDB: 4TR6 и 3KDK для слияния B. subtilis ). Первоначальные модели были уточнены с помощью итерационных циклов ручного построения моделей в Coot и уточнения в PHENIX (28,29).Количественный анализ интерфейсов обеих структур проводился с помощью онлайн-сервера PISA (30). Рисунки, показывающие молекулярные структуры, были созданы с использованием PyMOL.

Таблица 1.

Статистика сбора и уточнения данных

2,2 (1,7)

923 923,616 25,0

3

3

0

Таблица 1.

Статистика сбора и уточнения данных

3

3

0

3

3

0

Анализ частоты мутаций

E.coli Варианты MutL

E. coli штаммы MG1655 и JW4128-1 были получены из Центра генетических запасов E. coli . Аллель Δ mutL720 :: kan из штамма JW4128-1 был трансдуцирован в MG1655 с использованием P1 vir (31), в результате чего был получен штамм MKS108. Культуры штамма MKS108, несущего либо pET15b, либо производное pET15b, экспрессирующее указанный белок MutL, выращивали при 37 ° в течение 12 часов с аэрацией в среде LB (10 г / л триптона Difco, 5 г / л экстракта дрожжей Difco, 10 г / л NaCl. ) с добавлением ампициллина (150 мкг / мл) и канамицина (40 мкг / мл).Насыщенные культуры серийно разводили в 0,8% физиологическом растворе и 100 мкл разведения 10 ^-6 ( n ≥ 15) наносили на чашки с агаром LB для определения титров культур. 300 мкл тех же неразбавленных культур ( n = 20) наносили на чашки с агаром LB с добавлением рифампицина (50 мкг / мл) для выявления спонтанных мутаций. Планшеты инкубировали при 37 ° в течение 12 часов перед подсчетом колоний, и частоту спонтанных мутаций каждого штамма определяли путем деления количества колониеобразующих единиц на чашках, содержащих рифампицин, на среднее количество колониеобразующих единиц на LB без рифампицина (10, 32).95% доверительные интервалы рассчитывались, как описано (32).

Анализ частоты мутаций

вариантов B. subtilis mutL

Каждый штамм был создан путем интеграции каждого мутанта mutL в локус amyE штамма mutL штамма B. subtilis для эктопической экспрессии с IPTG. Исходный материал для каждого штамма замораживали и хранили при -80 ° C. Штаммы PY79 дикого типа и изогенные штаммы ΔmutL вычеркивали на агаре LB; в то время как mutL ⁺ , mutL ^HK , mutL ^CBM были поражены на LB агаре с добавлением спектиномицина (100 мкг / мл) и IPTG (1 мМ) для роста в течение ночи.Обе чашки инкубировали в течение ночи при 30 ° C. На следующий день отдельные колонии собирали и культивировали в 2 мл LB и 200 мкМ IPTG, вращая при 37 ° C в течение 2–3 часов до OD ₆₀₀ 1–1,2. Один мл из каждой пробирки также осаждали при 11000 × g, и супернатант удаляли. Этот осадок ресуспендировали в 100 мкл 0,85% физиологического раствора и 100 мкл высевали на агар LB с добавлением рифампицина (100 мкг / мл). Затем суспензию клеток разбавляли 10 ^-6 и 100 мкл каждого штамма высевали на агар LB для определения общего количества жизнеспособных клеток.Затем планшеты инкубировали при 30 ° C и на каждом планшете оценивали количество колониеобразующих единиц. Чашки LB оценивали, если они содержали не менее 70 колоний. Анализ частоты мутаций проводили, как описано ранее (33). Всего на штамм использовали 11–15 независимых культур. Приведенная частота мутаций относится к PY79 дикого типа и согласуется с предыдущими исследованиями (26,34).

Образование сшивающего комплекса цистеина

Варианты B. subtilis MutL и β-clip были созданы, как описано ранее (10).Вкратце, β-зажим B. subtilis не имеет остатков цистеина, экспонируемых на поверхности, поэтому мы добавили дипептид Ser379 – Cys380 на крайнем С-конце белка (pAG 8807). Вариант с одним Cys эндонуклеазного домена MutL ^CTD (pAG 8803; остатки 433–627) включал точечные мутации E485C, C531S, C573S и C604S. Оба варианта были получены и очищены, как описано ранее (10). Вариант с одним Cys регуляторного домена MutL (pAG9148; MutL ^RGD -E485C / C531S / C573S) был создан с помощью сайт-направленного мутагенеза и получен, как описано в другом месте (6).Для образования комплексов между β-зажимом и эндонуклеазными или регуляторными доменами B. subtilis MutL β-зажим инкубировали либо с эндонуклеазой, либо с регуляторным доменом в соотношении 1: 1 до конечной концентрации 20 мкМ. . Пробы (1–2 мл) диализовали в 20 мМ Трис pH 7,6, 150 мМ KCl, 10 мМ DTT, 10% глицерине в течение 2 ч при 4 ° C. Затем смесь диализовали в буфере с добавлением 5 мМ DTT в течение 1 часа, затем 1 час в буфере для диализа без DTT. Затем образец оставляли в буфере для диализа без DTT.Образование комплекса контролировали путем разделения образцов, собранных в разные моменты времени на денатурирующих гелях с градиентом полиакриламида, окрашенных кумасси бриллиантовым синим. Мы количественно оценили интенсивности поперечно-сшитых видов зажима + CTD и зажима + RGD в ImageJ и нормализовали значения, используя интенсивность полосы, соответствующей свободному зажиму, в каждом эксперименте, чтобы учесть различия в нагрузке между дорожками. Отношение I (зажим + RGD) / I (зажим) составляло 0,9 ± 0,01 по всем временным точкам. Отношение I (зажим + CTD) / I (зажим) составляло 1.0 на 1-й день, увеличился до 1,18 ± 0,1 на 2-й день и остался таким же на 3-й день, указывая на то, что реакция завершилась на 2-й день. угловое рассеяние рентгеновских лучей (10). Чтобы оценить, похожи ли конформационные изменения, предсказанные в нашей модели, на структуру B. subtilis Cys-сшитого комплекса Clamp-MutL ^CTD в растворе, мы рассчитали теоретические профили рассеяния для двух потенциальных конформаций комплекса с использованием CRYSOL ( 35).

Нуклеазный анализ

Тесты на нуклеазу

проводили, как описано ранее, с небольшими изменениями (10). ДНК-субстрат из 195 пар оснований амплифицировали из pUC19 (нуклеотиды 378-572) с использованием праймеров ^{5 ‘} d (AGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC) и 6-карбоксифлуоресцеин- ^5′ d (TGTAAAACGACGGCCAGTGAATGTCGAG). Варианты MutL ^CTD , несущие точечные мутации в мотиве эндонуклеазы (E468K), мотиве ⁴⁴³ GQ (G443K и Q444E) и мотиве связывания зажима ( ⁴⁸⁷ QEMIV ⁴⁹¹ → ⁴⁸⁷ 491 AEMAA ⁴⁸⁷ 491 ) были вызваны побочным мутагенезом.Все варианты были очищены, как описано в [10]. Каждый вариант MutL ^CTD (1,2 мкМ) затем инкубировали с линейным ДНК-субстратом 195 п.н. (10 нМ) в отсутствие и в присутствии эквимолярных количеств β-зажима в реакционном буфере (20 мМ Tris pH 7,6, 30 мМ KCl , 1 мМ MnCl ₂ , 1 мМ MgCl ₂ , 152 пМ Zn (O ₂ CCH ₃ ) ₂ , 0,05 мг / мл БСА, 4% глицерина). Реакции инкубировали при 37 ° C в течение 2 часов и гасили добавлением 25 мМ EDTA и 1 мг / мл протеиназы K с последующей инкубацией при 55 ° C в течение 20 минут.Продукты расщепления разделяли гель-электрофорезом в 8% денатурирующих полиакриламидных гелях. Гели визуализировали с помощью Typhoon Trio + (GE Healthcare).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Стабилизация комплекса MutL-зажим

E. coli и B. subtilis MutL образуют слабые, но специфические взаимодействия со своими соответствующими скользящими β-зажимами (6,10). Домен димеризации MutL организован в две независимо свернутые области, соединенные α-спиралью, которая в случае B.subtilis MutL, содержит мотив эндонуклеазы (26). N- и C-концы домена MutL определяют интерфейс димеризации белка, а промежуточная область определяет независимо свернутый субдомен (Рисунок 1). Этот субдомен часто называют регуляторным субдоменом, потому что он обеспечивает взаимодействие со скользящим β-зажимом. Клэмп-связывающий мотив MutL расположен на N-конце регуляторного субдомена (рис. 1A-B). Поскольку скользящий β-зажим взаимодействует со своими партнерами по связыванию через консервативную бороздку, расположенную на его С-конце, мы стабилизировали взаимодействие, соединив две полипептидные цепи коротким линкером — подход, который успешно использовался для стабилизации другого слабого белка — белковые взаимодействия для кристаллографических исследований (36–39).Слияния E. coli и B. subtilis могут быть очищены до гомогенности и элюированы с эксклюзионной хроматографической колонки при удерживаемых объемах, соответствующих ожидаемой массе для каждого комплекса (рис. 1C-D).

Регуляторный домен

E. coli MutL образует монодентатное взаимодействие с β-зажимом

Кристаллы β-Clamp E. coli , слитые с регуляторным доменом MutL (MutL ^RGD , остатки 471–574), дифрагированные до 2.1 Å (таблица 1). Асимметричная единица содержала один димер слияния (рис. 2А), где и зажим-димер, и два регуляторных субдомена MutL имели сходные общие структуры с отдельными белками. Наложение регуляторного субдомена из исходной структуры эндонуклеазного домена MutL на часть слияния MutL ^RGD приводит к среднеквадратичному отклонению (rmsd) 0,495 Å (518 атомов), тогда как наложение структуры β-Clamp, связанный с каноническим β-связывающим пептидом на мономере β-Clamp, дает среднеквадратичное значение 0.628 Å (2211 атомов). Для обоих протомеров кольца фиксирующий мотив MutL ( ⁴⁸² Q PL L IP ⁴⁸⁷ ) находится наверху сайта связывания β-зажима в идентичных ориентациях и демонстрирует четко определенную электронную плотность. (Дополнительный рисунок S1B). Линкер, соединяющий обе половины слияния, однако, неупорядочен в обоих протомерах димера, предполагая, что ассоциация между двумя белками удерживается вместе за счет взаимодействий между связывающим зажимом мотивом MutL и β-зажимом, а не наложенными ограничениями. компоновщиком.

Рисунок 2.

Взаимодействие между E. coli MutL ^RGD и β-зажимом. ( A ) Кристаллическая структура слияния E. coli Clamp-MutL ^RGD с β-фиксирующим кольцом, показанным как полупрозрачная поверхность, и двумя регуляторными доменами MutL, связанными с кольцом, показанными серыми лентами. ( B ) Детали взаимодействия между β-связывающим мотивом E. coli MutL ^RGD и консервативными субсайтами 1 (красный) и 2 (голубой) на поверхности β-зажима.Консервативные остатки β-связывающего мотива показаны, а также сульфат-ион, занимающий субсайт 2, отмеченными цветом. Этот вид ортогонален панели (A). ( C ) Сеть водородных связей, стабилизирующая взаимодействие сульфат-иона, обнаруженного в подсайте 2. Остатки от MutL ^RGD и β-зажима, соответственно, показаны серым и бледно-желтым цветом, а водородные связи показаны пунктирными линиями. Молекулы воды показаны красными сферами. Карта электронной плотности 2Fo-Fc для сульфат-иона показана в виде золотой сетки с контуром 1.2 σ. ( D ) Детали взаимодействия консервативного Gln482 MutL ^RGD и С-концевой цепи β-зажима. ( E ) Частота мутаций, связанных с вариантами MutL-R531S / Q532A (RQ) и MutL-L528A / R531S / Q532A (LRQ), по сравнению со штаммом mutL , дефицитным E. coli , дополненным пустым вектором ( пусто) или MutL дикого типа (WT). Планки погрешностей представляют собой верхнюю и нижнюю границы 95% доверительных интервалов (32).

Рисунок 2.

Взаимодействие между E. coli MutL ^RGD и β-зажимом. ( A ) Кристаллическая структура слияния E. coli Clamp-MutL ^RGD с β-фиксирующим кольцом, показанным как полупрозрачная поверхность, и двумя регуляторными доменами MutL, связанными с кольцом, показанными серыми лентами. ( B ) Детали взаимодействия между β-связывающим мотивом E. coli MutL ^RGD и консервативными субсайтами 1 (красный) и 2 (голубой) на поверхности β-зажима.Консервативные остатки β-связывающего мотива показаны, а также сульфат-ион, занимающий субсайт 2, отмеченными цветом. Этот вид ортогонален панели (A). ( C ) Сеть водородных связей, стабилизирующая взаимодействие сульфат-иона, обнаруженного в подсайте 2. Остатки от MutL ^RGD и β-зажима, соответственно, показаны серым и бледно-желтым цветом, а водородные связи показаны пунктирными линиями. Молекулы воды показаны красными сферами. Карта электронной плотности 2Fo-Fc для сульфат-иона показана в виде золотой сетки с контуром 1.2 σ. ( D ) Детали взаимодействия консервативного Gln482 MutL ^RGD и С-концевой цепи β-зажима. ( E ) Частота мутаций, связанных с вариантами MutL-R531S / Q532A (RQ) и MutL-L528A / R531S / Q532A (LRQ), по сравнению со штаммом mutL , дефицитным E. coli , дополненным пустым вектором ( пусто) или MutL дикого типа (WT). Планки погрешностей представляют собой верхнюю и нижнюю границы 95% доверительных интервалов (32).

Исследования с использованием коротких пептидов показали, что канонические фиксирующие мотивы связываются с двумя сайтами на E.coli β-зажим, обозначаемый как подсайты 1 и 2 (дополнительный рисунок S1) (19). Консервативный Leu485 клэмп-связывающего мотива занимает консервативный гидрофобный карман, известный как субсайт 1 (рисунок 2B и дополнительный рисунок S1). Как и в других мотивах связывания зажима, следующий остаток, Ile486, также находится внутри этого гидрофобного кармана (рис. 2В). Однако в отличие от других мотивов, связывающих зажим, консервативный Gln482 не занимает субпозицию 2. Вместо этого сульфат-ион из кристаллизационного раствора занимает этот карман и повторяет взаимодействия, обычно опосредованные амидным фрагментом консервативного глутамина (рис. 2B- C).Ион образует сеть водородных связей, включающую боковые цепи Asn320 из β-зажима и Arg531 и Gln532 из MutL, а также опосредованные водой водородные связи с основной цепью His175, Asn320, Met362 и Pro363 (рис. 2C и Дополнительный рисунок S2). Кроме того, боковая цепь Leu528 из MutL зажата между боковыми цепями Phe278 и Met364 из β-зажима и закрывает субсайт 2. Хотя взаимодействия в субсайте 2 не сохраняются, общая ширина канавки связывания аналогична другой. структуры β-зажима связаны с мотивами связывания зажима (дополнительный рисунок S2).Когда консервативный глутамин зажима-связывающего мотива занимает субсайт 2, как это происходит в случае Pol II (дополнительный рисунок S2), его боковая цепь образует водородную связь с карбонильной группой Met362, эффективно ограничивая ширину бороздки. . Здесь сульфат-ион образует водородную связь с той же группой, а гуанидиниевая группа Arg531 дополнительно ограничивает ширину кармана, образуя водородную связь с карбонильной группой Pro363 (рис. 2C-D). Кроме того, боковая цепь Gln482 образует бидентатную водородную связь с основной цепью Arg365 от β-зажима (рис. 2D).

В канонических мотивах связывания зажима остаток, следующий за консервативным глутамином, также является консервативным (рис. 1А), и он занимает неглубокий карман напротив кармана связывания Gln, дополнительно стабилизируя бидентатное взаимодействие между β-зажимом и его партнерами по связыванию. Вторая позиция мотива не консервативна в гомологах MutL (рис. 1А). В E. coli MutL, Pro483 следует за консервативным Gln482 (дополнительные рисунки S1 и S2). Хотя конформация основной цепи сходна с другими мотивами, связывающими зажим, ограниченные углы phi / psi Pro483 и его меньший размер, вероятно, благоприятствуют монодентатному взаимодействию с β-зажимом.Мы не можем сказать, вытесняет ли сульфат-ион Gln482 из субсайта 2 или заполняет пустой карман, но мы показали, что замена остатка MutL E. coli Gln482 на Ala не влияет на функцию репарации ошибочного спаривания in vivo , тогда как замена Leu485 с Ala вызывает мутаторный фенотип (6). Эта структура поддерживает идею о том, что Leu485 управляет взаимодействием между E. coli MutL и β-зажимом.

Остатки MutL, взаимодействующие с субсайтом 2, не обязательны для взаимодействия с β-фиксатором

Учитывая роль Arg531, Gln532 и Leu528 в стабилизации конформации субсайта 2 в структуре, мы проверили, влияют ли точечные мутации на этих остатках на активность репарации ошибочного спаривания in vivo .Мы создали двойной мутант MutL (MutL-R531S / Q532A), неспособный опосредовать электростатические взаимодействия с сульфат-ионом, а также тройной вариант (MutL-L528A / R531S / Q532A), в котором как электростатические, так и ван-дер-ваальсовые взаимодействия были отменены. Затем мы измерили частоту спонтанной мутации rpoB в устойчивость к рифампицину (Rif ^R ) для штаммов дикого типа и варианта mutL . Оба варианта демонстрировали сходные частоты мутаций с mutL дикого типа (фиг. 2E), что указывает на то, что взаимодействия, опосредованные этими тремя остатками в субсайте 2, не являются необходимыми для активности репарации ошибочного спаривания in vivo .Ранее мы показали, что нарушение взаимодействия MutL-Clamp вызывает умеренный мутаторный фенотип у E. coli (6), поэтому мы пришли к выводу, что остатки Arg531, Gln532 и Leu528 MutL не являются необходимыми для функционального взаимодействия с β -зажим при несоответствии ремонта.

Регуляторный домен

B. subtilis MutL образует бидентатное взаимодействие с β-зажимом

В отличие от E. coli MutL, взаимодействие между B.subtilis MutL и β-Clamp необходимы для активности репарации несовпадений in vivo (26). Поэтому мы стремились определить, образует ли B. subtilis MutL также монодентатное взаимодействие с β-зажимом. Кристаллы β-Clamp B. subtilis , слитые с регуляторным доменом MutL (MutL ^RGD , остатки 482–574), содержат два димера β-Clamp в асимметричной единице. Два протомера димера β-Clamp были практически идентичны друг другу (среднеквадратичное значение 0.438 Å более 2165 атомов) и β-зажим B. subtilis самостоятельно (PDB ID: 4TR6). Два регуляторных домена MutL на каждом димере β-Clamp взаимодействуют с β-Clamp посредством канонического бидентатного взаимодействия, наблюдаемого для др. Взаимодействующих с зажимом партнеров (Рисунок 3 и дополнительные рисунки S1 и S2). Боковые цепи консервативных остатков изолейцина и глутамина в мотиве ( ⁴⁸⁷ Q EM I VP ⁴⁹² ) занимают субсайты 1 и 2 β-зажима.Присутствие линкера не определяет взаимодействие, потому что линкер, соединяющий B. subtilis β-зажим и MutL половинки слияния, виден только в одном из протомеров димера, но обе копии имеют один и тот же способ связывания ( Дополнительный рисунок S3).

Рисунок 3.

Взаимодействие между B. subtilis MutL и β-зажимом. ( A ) Противоположные виды регуляторных доменов MutL из структуры B.subtilis Clamp-MuL слияние (зеленый и синий), наложенное на структуру MutL ^RGD (серый, PDB ID 3KDK). ( B ) Деталь кристаллической структуры слияния B. subtilis зажим-MutL с β-зажимным кольцом, показанным в виде полупрозрачной поверхности, и регуляторным доменом MutL, показанным в виде зеленой ленты. Консервативные остатки β-связывающего мотива показаны в виде полосок с цветовой кодировкой и помечены. Карманы консервативного связывания β-зажима окрашены в красный (субсайт 1) и синий (субсайт 2).( C ) Детали остатков петли β7-αC, способствующие стабилизации субсайта 2. ( D ) Частота мутаций a (PY79 дикого типа) и изогенных Δ mutL штаммов, а также Δ mutL Штамм , дополненный MutL дикого типа (Δ mutL / mutL ⁺ ), MutL-H532A / K538A (Δ mutL / mutL ^HK ) или MutL-CBM (Δ mutL / mutL ^HK ) ). Комплементарные аллели экспрессировали из эктопического хромосомного локуса с 200 мкМ IPTG.Планки погрешностей указывают на стандартную ошибку среднего.

Рисунок 3.

Взаимодействие между B. subtilis MutL и β-зажимом. ( A ) Противоположные виды регуляторных доменов MutL из структуры слияния зажима-MuL B. subtilis (зеленый и синий), наложенного на структуру MutL ^RGD (серый, PDB ID 3KDK). ( B ) Деталь кристаллической структуры слияния B. subtilis зажим-MutL с β-зажимным кольцом, показанным в виде полупрозрачной поверхности, и регуляторным доменом MutL, показанным в виде зеленой ленты.Консервативные остатки β-связывающего мотива показаны в виде полосок с цветовой кодировкой и помечены. Карманы консервативного связывания β-зажима окрашены в красный (субсайт 1) и синий (субсайт 2). ( C ) Детали остатков петли β7-αC, способствующие стабилизации субсайта 2. ( D ) Частота мутаций a (PY79 дикого типа) и изогенных Δ mutL штаммов, а также Δ mutL Штамм , дополненный MutL дикого типа (Δ mutL / mutL ⁺ ), MutL-H532A / K538A (Δ mutL / mutL ^HK ) или MutL-CBM (Δ mutL / mutL ^HK ) ).Комплементарные аллели экспрессировали из эктопического хромосомного локуса с 200 мкМ IPTG. Планки погрешностей указывают на стандартную ошибку среднего.

Однако связывание с β-зажимом вызывает конформационные изменения в регуляторном домене MutL. Наложение домена на исходную структуру эндонуклеазного домена B. subtilis MutL (PDB ID 3KDK) приводит к среднеквадратичному значению> 1,5 Å, что в первую очередь вызвано изменениями относительной ориентации связывающего зажима мотива и спиралей αB-αD. (Рисунок 3A).Петля β5 – αB, как и часть спирали αD, неупорядочена в обоих протомерах. В протомере с упорядоченным линкером последний виток спирали αB, петля, соединяющая эту спираль с β6, и спираль αD также неупорядочены (рис. 3A, показано синим цветом). Однако последние два витка спирали αD видны в протомере с неупорядоченным линкером (Рисунок 3A-B и дополнительный рисунок S3). Это первая структура β-зажима B. subtilis , связанная с одним из его партнеров по связыванию, но кинетические исследования показали, что B.β-Clamp subtilis связывает модельный Clamp-связывающий пептид с аналогичной аффинностью с β-Clamp E. coli (40). Это указывает на то, что бидентатное связывание также является каноническим способом связывания для партнеров по зажиму B. subtilis . Эта структура также показывает, что образование этого бидентатного взаимодействия вызывает дополнительные конформационные изменения, когда мотив связывания зажима встроен в структурированный домен.

Никаких дополнительных остатков в регуляторном домене не требуется для взаимодействия

B.subtilis MutL и β-зажим

Индуцированная гибкость регуляторного домена MutL B. subtilis позволяет мотиву ⁴⁸⁷ Q EM I VP ⁴⁹² проникать в гидрофобную бороздку связывающего β-зажима. Это, в свою очередь, приближает окружающие петли регуляторного субдомена к поверхности β-зажима. Петля, соединяющая β7 ‘цепь со спиралью αC, оборачивается вокруг субсайта 2, определяя сложную сеть водородных связей, включающую боковые цепи His532 и Lys538 из MutL, а также боковые цепи His182, Ser331 и Tyr334 из β-зажима. в качестве карбонила основной цепи Trp535 (MutL) и аминогруппы Ala287 (β-зажим) (рис. 3С).Чтобы проверить актуальность этой сети водородных связей, мы создали штамм mutL ( mutL ^HK ), в котором His532 и Lys538 были мутированы до остатков аланина. Каждый аллель mutL экспрессировался из эктопического хромосомного локуса с концентрацией IPTG, которая дает экспрессию mutL на уровне, неотличимом от уровня mutL дикого типа (41). Штамм Δ mutL / mutL ^HK имел частоту мутаций, аналогичную штамму Δ mutL , дополненному MutL дикого типа (Δ mutL / mutL ⁺ ), в отличие от штамма с мутировавшим зажимом связывающий мотив (Δ mutL / mutL ^CBM ), который имел частоту мутаций, эквивалентную штамму Δ mutL , у которого отсутствует комплементарный аллель (фигура 3D).Эти результаты показывают, что изменения относительной ориентации спиралей αB-αD усиливают форму и зарядовую комплементарность с β-зажимом, но функциональное взаимодействие MutL и β-зажима остается исключительно опосредованным доменом связывания зажима.

Переориентация спиралей αB-αD выравнивает мотив эндонуклеазы с каналом β-зажима

Наложение эндонуклеазного домена MutL (PDB ID: 3KDK) с использованием мотива связывания зажима в качестве ссылки привело к значительным конфликтам между дистальным протомером димера MutL и β-зажимом (рис. 4A и дополнительный фильм 1).Однако наложение эндонуклеазного домена с учетом переориентации спиралей αB-αD при связывании с β-зажимом разрешило большинство конфликтов (рис. 4B и дополнительный ролик 1). Эндонуклеазный домен MutL, сшитый с β-зажимом, был охарактеризован с помощью малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (10), поэтому мы сравнили две конформации модели с конформацией комплекса MutL ^CTD -clamp в растворе. С этой целью мы рассчитали теоретические кривые рассеяния для двух потенциальных конформаций с помощью CRYSOL (35).Затем мы сравнили их с экспериментальной кривой рассеяния сшитого комплекса, в результате чего на chi ² были получены значения 11,22 (рис. 4A и 4C) и 3,28 (рис. 4B и 4D). Эти значения chi ² показывают, что наложение эндонуклеазного домена с учетом переориентации спиралей αB-αD очень похоже на конформацию комплекса в растворе (рис. 4B). Интересно, что домен димеризации E. coli MutL может быть непосредственно наложен на структуру слияния без серьезных конфликтов (дополнительный рисунок S4A), что позволяет предположить, что конформационные изменения регуляторного субдомена в B.subtilis MutL может быть важным из-за его нуклеазной активности.

Рисунок 4.

Конформационные изменения MutL ^RGD после привязки к зажиму. Ленточная диаграмма димера эндонуклеазного домена B. subtilis MutL (розовый), наложенного на B. subtilis слияния Clamp-MutL (бледно-желтый и зеленый) с использованием либо фиксирующего мотива ( A ), либо положения спиралей αB-αD ( B ) в качестве эталона.Переориентация спиралей αB-αD выравнивает мотив эндонуклеазы MutL с центральной полостью β-зажима и предотвращает конфликты со вторым протомером димера (красный кружок). ( C ) Теоретическая кривая рассеяния раствора модели, показанной на панели (A), наложенная на экспериментальную кривую рассеяния раствора Cys-сшитого комплекса между β-зажимом B. subtilis и эндонуклеазным доменом B. subtilis MutL. ( D ) Теоретическая кривая рассеяния раствора модели, показанной на панели (B), наложенная на экспериментальную кривую рассеяния раствора Cys-сшитого комплекса между B.subtilis β-Clamp и эндонуклеазный домен B. subtilis MutL.

Рис. 4.

Конформационные изменения MutL ^RGD после привязки к зажиму. Ленточная диаграмма димера эндонуклеазного домена B. subtilis MutL (розовый), наложенного на B. subtilis слияния Clamp-MutL (бледно-желтый и зеленый) с использованием либо фиксирующего мотива ( A ), либо положения спиралей αB-αD ( B ) в качестве эталона.Переориентация спиралей αB-αD выравнивает мотив эндонуклеазы MutL с центральной полостью β-зажима и предотвращает конфликты со вторым протомером димера (красный кружок). ( C ) Теоретическая кривая рассеяния раствора модели, показанной на панели (A), наложенная на экспериментальную кривую рассеяния раствора Cys-сшитого комплекса между β-зажимом B. subtilis и эндонуклеазным доменом B. subtilis MutL. ( D ) Теоретическая кривая рассеяния раствора модели, показанной на панели (B), наложенная на экспериментальную кривую рассеяния раствора Cys-сшитого комплекса между B.subtilis β-Clamp и эндонуклеазный домен B. subtilis MutL.

Конформация модели, изображенной на рисунке 4B, выравнивает мотив нуклеазы взаимодействующего протомера MutL с центральной полостью β-зажима. Это хорошо согласуется с данными, показывающими, что B. subtilis MutL требует только эндонуклеазный сайт от протомера, связанного с β-зажимом для нуклеазной активности (42), и подтверждает идею о том, что роль PCNA и β-зажима на этом этапе происходит нанизывание ДНК на сайт нуклеазной активности (12).

Консервативный мотив GQ помогает выровнять димер MutL с центральной полостью β-зажима

гомологов MutL, несущих мотив эндонуклеазы, также несут четыре дополнительных мотива (9). Структура эндонуклеазного домена B. subtilis MutL выявила, что три из этих мотивов ( ⁵⁷² SCK, ⁶⁰⁴ CPHGRP, ⁶²³ FKR) вместе с мотивом эндонуклеазы ( ⁴⁶² DQHAAQERIKYE) определяют эндонуклеазный сайт и координируют два иона металла цинка, необходимые для активности MutL (26).Четвертый мотив ( ⁴⁴³ GQ) расположен на границе димеризации MutL, и ему нельзя было приписать специфическую функцию из структуры эндонуклеазного домена B. subtilis MutL. Взаимодействие между MutL и β-зажимом помещает этот мотив в непосредственной близости от петель β-зажима α1-β2 (Ala22-Thr33), β3- β4 (Ser49-Asp52) и α4-β11 (Ser156-Gly166) и , следовательно, консервативные малые и полярные остатки в этих положениях могут предотвращать стерические затруднения.

Чтобы проверить эту возможность, мы создали варианты эндонуклеазного домена B.subtilis MutL (BsMutL ^CTD ), включая точечные мутации в мотиве ⁴⁴³ GQ, и протестировали их способность разрывать линейный субстрат ДНК. Ранее нами было показано, что нуклеазная активность B. subtilis MutL стимулируется β-зажимом (10). Поэтому мы проверили, способны ли эти варианты разрушать ДНК-субстрат (рис. 5А). Как и ожидалось, BsMutL ^CTD был способен разрушать ДНК-субстрат в присутствии β-зажима, но варианты BsMutL ^CTD , неспособные связывать β-зажим или с точечной мутацией в мотиве эндонуклеазы, не проявляли нуклеазной активности. (Рисунок 5A).Варианты BsMutL ^CTD -G443K и BsMutL ^CTD -Q444E обладали остаточной нуклеазной активностью (фиг. 5A), что указывает на то, что целостность мотива ⁴⁴³ GQ важна для нуклеазной активности. Основываясь на нашей модели и дефектах эндонуклеаз, связанных с мутациями в мотиве ⁴⁴³ GQ, мы предсказали, что дополнительные поверхности за пределами регуляторного домена B. subtilis MutL могут стабилизировать взаимодействие с β-зажимом.

Рисунок 5.

Мотивы за пределами регуляторного субдомена B. subtilis MutL важны для нуклеазной активности и связывания с β-зажимом. ( A ) Анализ нуклеазной активности для MutL ^CTD (WT) и вариантов домена с точечными мутациями в мотиве ⁴⁴³ GQ (G443K и Q444E), мотиве нуклеазы (E468K) и зажиме мотив ( ⁴⁸⁷ QEMIV → ⁴⁸⁷ AEMAA, CBM ^(-) ) на флуоресцентно меченой линейной ДНК длиной 195 п.н. (10 нМ).Активность нуклеазы зависит от наличия (+) и способности взаимодействовать с β-зажимом. ( B ) Одноцистеиновые варианты β-зажима, а также эндонуклеазный (MutL ^CTD ) и регуляторный (MutL ^RGD ) домены B. subtilis MutL были очищены и были очищены в эквимолярных смесях обоих зажимов. -MutL ^CTD или Clamp-MutL ^RGD инкубировали в отсутствие восстанавливающих агентов. Образцы, взятые из реакции в указанные моменты времени, разделяли на денатурирующих гелях в отсутствие β-меркаптоэтанола.Количественная оценка полос, соответствующих сшитому типу зажима + MutL ^CTD или зажиму + MutL ^RGD по отношению к свободному зажиму, показана под гелем.

Рисунок 5.

Мотивы за пределами регуляторного субдомена B. subtilis MutL важны для нуклеазной активности и связывания с β-зажимом. ( A ) Анализ нуклеазной активности для MutL ^CTD (WT) и вариантов домена с точечными мутациями в мотиве ⁴⁴³ GQ (G443K и Q444E), мотиве нуклеазы (E468K) и зажиме мотив ( ⁴⁸⁷ QEMIV → ⁴⁸⁷ AEMAA, CBM ^(-) ) на флуоресцентно меченой линейной ДНК длиной 195 п.н. (10 нМ).Активность нуклеазы зависит от наличия (+) и способности взаимодействовать с β-зажимом. ( B ) Одноцистеиновые варианты β-зажима, а также эндонуклеазный (MutL ^CTD ) и регуляторный (MutL ^RGD ) домены B. subtilis MutL были очищены и были очищены в эквимолярных смесях обоих зажимов. -MutL ^CTD или Clamp-MutL ^RGD инкубировали в отсутствие восстанавливающих агентов. Образцы, взятые из реакции в указанные моменты времени, разделяли на денатурирующих гелях в отсутствие β-меркаптоэтанола.Количественная оценка полос, соответствующих сшитому типу зажима + MutL ^CTD или зажиму + MutL ^RGD по отношению к свободному зажиму, показана под гелем.

Используя одноцистеиновые варианты β-зажима, а также эндонуклеазные и регуляторные домены B. subtilis MutL, которые мы ранее разработали для характеристики малоуглового рассеяния рентгеновских лучей (10), мы протестировали может ли димер эндонуклеазы (MutL ^CTD ) легче взаимодействовать с β-зажимом, чем с регуляторным доменом (MutL ^RGD ).Инкубация регуляторных и эндонуклеазных доменов MutL с β-зажимом в отсутствие восстанавливающих агентов приводила к образованию сшитых видов при 63 и 75 кДа, что согласуется с взаимодействием обоих доменов с β-зажимом (рис. 5B). Неожиданно, виды 75 кДа (зажим + MutL ^CTD ) и 63 кД (зажим + MutL ^RGD ) накапливались в аналогичных количествах (рис. 5В). Ранее мы показали, что только один из двух протомеров димера эндонуклеазного домена может взаимодействовать с димером зажима, поскольку связывание частично блокирует второй сайт связывания β-зажима (10).Таким образом, образование комплекса приводит к сшиванию гелей, которые имеют одинаковое количество комплекса (Clamp + MutL ^CTD ) и свободного β-Clamp (Рисунок 5B). Напротив, регуляторный домен является мономером, и два регуляторных домена могут одновременно связываться с β-зажимным кольцом. Однако количественная оценка сшивающих гелей также показала равные количества разновидностей 63 кДа и свободного β-зажима, и это соотношение сохранялось с течением времени (фиг. 5B). Следовательно, либо регуляторный домен имеет более низкое сродство к β-зажиму, чем домен эндонуклеазы, либо связывание с одним сайтом запускает аллостерическое изменение, которое предотвращает связывание со вторым сайтом.Хотя мы не можем исключить вклад аллостерических эффектов, мы ранее наблюдали, что варианты MutL с более низким сродством к β-зажиму имеют тенденцию образовывать неспецифические поперечные сшивки более высокого порядка в этом анализе (10). Реакции, содержащие регуляторный домен MutL, дают четко определенные сшитые виды более высокого порядка (рис. 5B), поэтому мы поддерживаем идею о том, что эндонуклеазный домен имеет более высокое сродство, чем регуляторный домен для β-зажима, и что консервативный мотив GQ может вносить свой вклад. к усилению взаимодействия.

ОБСУЖДЕНИЕ

Структуры β-Clamp, связанные с регуляторными доменами MutL, являются первыми, описывающими, как β-Clamp распознает мотивы связывания внутреннего зажима, встроенные в структурированные домены. B. subtilis MutL имеет характерное бидентатное взаимодействие со своим β-зажимом, тогда как E. coli MutL образует монодентатное взаимодействие со своим β-зажимом. Предыдущие исследования показали, что линейные связывающие зажимы мотивы связываются с E.coli β-Clamp в двухэтапном процессе, который сначала включает гидрофобный субсайт, а затем следует ориентация и связывание фланкирующих остатков с субсайтом 2 (43). Таким образом, структура слияния E. coli Clamp-MutL, по-видимому, визуализирует первый этап связывания. Взаимодействие между E. coli MutL и β-зажимом важно, но не существенно, для репарации ошибочного спаривания ДНК in vivo (6). Фактически точечные мутации консервативного Gln, который обычно занимает субсайт 2, не вызывают мутаторного фенотипа, и, таким образом, мы предполагаем, что E.coli MutL, возможно, не потребуется задействовать второй подсайт. Напротив, эндонуклеазная активность B. subtilis MutL зависит от взаимодействия с β-зажимом. В отличие от E. coli MutL, регуляторный домен B. subtilis MutL образует каноническое бидентатное взаимодействие с β-зажимом. Однако взаимодействие связано с конформационными изменениями в регуляторной области. Движение спиралей αB-αD при связывании с β-зажимом обеспечивает стерическую и электростатическую комплементарность поверхности MutL, окружающей мотив связывания зажима, и помогает выровнять мотив эндонуклеазы с центральной полостью β-зажима (рис. Дополнительный фильм 1).Следовательно, различия между двумя структурами, вероятно, повторяют актуальность взаимодействия у каждого вида.

β-зажим был идентифицирован как потенциальная противомикробная мишень (44). Несмотря на структурную консервацию сайтов связывания у разных видов, разные организмы распознают мотивы связывания с зажимом с разной аффинностью (40). Два режима взаимодействия, наблюдаемые в структурах β-зажимов E. coli и B. subtilis , слитых с регуляторным доменом MutL, предполагают, что, несмотря на сохранение мотива и субсайтов связывания, взаимодействия за пределами связывания зажима мотив может модулировать взаимодействие.Это, по-видимому, имеет место для консервативного мотива GQ, обнаруженного в домене димеризации B. subtilis MutL (Фигуры 4 и 5). Работа с короткими пептидами не может повторить эти дополнительные взаимодействия и, следовательно, структурная характеристика более крупных комплексов, связанных с зажимом, остается приоритетом для изучения истинного потенциала β-зажима как мишени для лекарственного средства.

PCNA- и фиксирующие мотивы часто содержат один или два ароматических остатка на конце мотива (рис. 1A). Их присутствие считалось необходимой сигнатурой для определения специфичности связывания (13).Однако связывающие мотивы для MLh2 (мотив MIP) и Rev1 (мотив RIR) также имеют соседние ароматические остатки, предполагая, что специфичность связывания для PCNA определяется особенностями мотива за пределами этих ароматических остатков. Действительно, у гомологов MutL отсутствует пара ароматических остатков на конце связывающего мотива, но они специфически связываются со своими родственными зажимами. Кроме того, мотив связывания зажима, обнаруженный в гомологах MutL, включает консервативный остаток пролина — общий признак внутренних мотивов связывания зажима.Этот пролин помогает экспонировать связывающий мотив зажима для растворителя, но конформационные изменения способствуют каноническому бидентатному взаимодействию между B. subtilis MutL и β-зажимом.

Стыковка нуклеазного домена Saccharomyces cerevisiae MutLα (PDB ID 4E4W) в структуру PCNA не приводит к стерическим конфликтам между MLh2 димера, но эндонуклеазный мотив PMS1 не совмещен с центральной полостью PCNA. (Дополнительный рисунок S4B). PCNA усиливает эндонуклеазную активность MutLα человека и дрожжей и обеспечивает направленность реакции никинга (8,12,45).Следовательно, гибкость регуляторного домена дрожжевого PMS1 и человеческого PMS2 также может быть необходима для выравнивания эндонуклеазного мотива с центральной полостью PCNA. Мы прогнозируем, что конформационные изменения внутри доменов, несущих мотив связывания зажима, могут быть общим признаком взаимодействий всех гомологов MutL с эндонуклеазной активностью, а также других белков, содержащих внутренние мотивы связывания зажима.

Поскольку в настоящее время доступны структуры β-Clamp и PCNA, связанные с ДНК (46,47), возникает соблазн предположить, как MutL распознает недавно синтезированную цепь дуплекса ДНК.Однако как PCNA, так и слайд β-clip на ДНК и, следовательно, кристаллические структуры не имеют информации о динамике взаимодействия. Понимание динамики взаимодействия зажим-ДНК будет иметь первостепенное значение для выяснения того, как β-зажим — и PCNA — представляют недавно синтезированную цепь белкам MutL.

НАЛИЧИЕ ДАННЫХ

Две кристаллические структуры, описанные в этой статье, были депонированы в базе данных белков под идентификаторами 6E8D и 6E8E.

Банкноты

Нынешний адрес: Моника К. Пиллон, Национальный институт наук о здоровье окружающей среды, Национальные институты здравоохранения США, Парк Исследовательского треугольника, Северная Каролина, США.

Нынешний адрес: Мишель К. Шотландия, Корнельский университет, Итака, штат Нью-Йорк, США.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ДАННЫЕ

Дополнительные данные доступны в NAR Online.

БЛАГОДАРНОСТИ

Мы благодарим доктора Мартина Шмайнга за помощь в подготовке Дополнительного фильма 1, а также бывших и нынешних сотрудников лаборатории Гуарне за стимулирующие обсуждения.

Вклад авторов : A.W.A., M.C.P., A.G., M.K.S., M.D.S., J.R.R., L.A.S. разработал эксперименты и проанализировал данные. A.W.A., L.L., M.K.S., J.R.R., H.K.M., Y.S., L.S. провели эксперименты и подготовили цифры. A.G. написал рукопись при участии всех авторов.

ФИНАНСИРОВАНИЕ

Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR) [MOP-67189 to A.G.]; Совет по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) [288295 к A.G.]; NIH [R01 GM066094 до M.D.S.]; NSF [MCB1050948 и MCB1714539 к L.A.S.]; J.R.R. была частично поддержана грантом NIH на обучение клеточной биотехнологии [T32 GM008353]; Рэкхемская аспирантура Мичиганского университета. Финансирование платы за открытый доступ: CIHR и NSERC.

Заявление о конфликте интересов . Ничего не объявлено.

ССЫЛКИ

1.

Heltzel

J.M.

,

Maul

R.W.

,

Scouten Ponticelli

S.K.

,

Sutton

M.D.

Модель переключения ДНК-полимеразы, включающая одиночную щель и край скользящего зажима

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2009

;

106

:

12664

—

12669

. 2.

Kath

J.E.

,

Chang

S.

,

Scotland

M.K.

,

Wilbertz

J.H.

,

Jergic

S.

,

Dixon

N.E.

,

Sutton

M.D.

,

Loparo

J.J.

Обмен между полимеразами Escherichia coli II и III на зажиме процессивности

.

Nucleic Acids Res.

2016

;

44

:

1681

—

1690

. 3.

Lopez de Saro

F.J.

,

O’Donnell

M.

Взаимодействие бета-скользящего зажима с MutS, лигазой и ДНК-полимеразой I

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2001

;

98

:

8376

—

8380

.4.

Молдавский

G.L.

,

Pfander

B.

,

Jentsch

S.

PCNA, маэстро репликационной вилки

.

Ячейка

.

2007

;

129

:

665

—

679

. 5.

Лопес де Саро

F.J.

,

Маринус

M.G.

,

Modrich

P.

,

O’Donnell

M.

Бета-скользящий зажим связывается с несколькими сайтами в MutL и MutS

.

J. Biol. Chem.

2006

;

281

:

14340

—

14349

.6.

Pillon

M.C.

,

Миллер

J.H.

,

Guarné

A.

Эндонуклеазный домен MutL взаимодействует с бета-скользящим зажимом

.

Восстановление ДНК (Amst.)

.

2011

;

10

:

87

—

93

.7.

Simmons

L.A.

,

Davies

B.W.

,

Grossman

AD

,

Walker

G.C.

Бета-зажим направляет локализацию исправления несоответствия в Bacillus subtilis

.

Мол. Ячейка

.

2008

;

29

:

291

—

301

.8.

Кадыров

Ф.A.

,

Dzantiev

L.

,

Constantin

N.

,

Modrich

P.

Эндонуклеолитическая функция MutLalpha при репарации несовпадений у человека

.

Ячейка

.

2006

;

126

:

297

—

308

.9.

Kosinski

J.

,

Plotz

G.

,

Guarné

A.

,

Bujnicki

J.M.

,

Friedhoff

P.

Субъединица PMS2 человеческого MutLalpha содержит домен связывания иона металла из семейства железозависимых репрессорных белков

.

J. Mol. Биол.

2008

;

382

:

610

—

627

.10.

Pillon

M.C.

,

Бабу

В.М.

,

Randall

J.R.

,

Cai

J.

,

Simmons

L.A.

,

Sutton

M.D.

,

Guarné

A.

Скользящий зажим прикрепляет эндонуклеазный домен MutL к ДНК

.

Nucleic Acids Res.

2015

;

43

:

10746

—

10759

. 11.

Genschel

J.

,

Kadyrova

L.Y.

,

Iyer

R.R.

,

Dahal

B.K.

,

Кадыров

F.A.

,

Modrich

P.

Взаимодействие ядерного антигена пролиферирующих клеток с PMS2 необходимо для активации MutLalpha и функции репарации ошибочного спаривания

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2017

;

114

:

4930

—

4935

.12.

Pluciennik

A.

,

Dzantiev

L.

,

Iyer

RR

,

Constantin

N.

,

Kadyrov

FA

0009000 9000

Функция Modrich9 в активации и направлении цепи эндонуклеазы MutLalpha при репарации ошибочного спаривания

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2010

;

107

:

16066

—

16071

. 13.

Boehm

E.M.

,

Washington

M.T.

R.I.P. к PIP: мотив связывания PCNA больше не считается специфическим: мотивы PIP и другие родственные последовательности не являются отдельными объектами и могут связывать множественные белки, участвующие в поддержании генома

.

Биологические исследования

.

2016

;

38

:

1117

—

1122

.14.

Армстронг

A.A.

,

Mohideen

F.

,

Lima

C.D.

Для распознавания SUMO-модифицированной PCNA требуются тандемные рецепторные мотивы в Srs2

.

Природа

.

2012

;

483

:

59

—

63

.15.

Dalrymple

B.P.

,

Kongsuwan

K.

,

Wijffels

G.

,

Dixon

N.E.

,

Дженнингс

П.A.

Универсальный мотив межбелкового взаимодействия в системах репликации и репарации эубактериальной ДНК

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2001

;

98

:

11627

—

11632

. 16.

Овсянка

К.А.

,

Roe

S.M.

,

Pearl

L.H.

Структурная основа для привлечения транслезионной ДНК-полимеразы Pol IV / DinB к бета-зажиму

.

EMBO J.

2003

;

22

:

5883

—

5892

. 17.

Патоли

A.A.

,

Зима

J.A.

,

Овсянка

К.А.

Субъединица UmuC ДНК-полимеразы V E. coli демонстрирует уникальное взаимодействие с фактором процессивности бета-зажима

.

BMC Struct. Биол.

2013

;

13

:

12

. 18.

Георгеску

R.E.

,

Юрьева

О.

,

Kim

S.S.

,

Kuriyan

J.

,

Kong

X.P.

,

O’Donnell

M.

Структура низкомолекулярного ингибитора скользящего зажима ДНК-полимеразы

.

Proc. Natl. Акад. Sci. США

2008

;

105

:

11116

—

11121

.19.

Burnouf

D.Y.

,

Olieric

V.

,

Wagner

J.

,

Fujii

S.

,

Reinbolt

J.

,

Fuchs

RP

,

Dumas

P.

Структурный и биохимический анализ взаимодействий скользящего зажима / лигандов позволяет предположить транслезионные ДНК-полимеразы

.

J. Mol. Биол.

2004

;

335

:

1187

—

1197

.20.

Xing

G.

,

Kirouac

K.

,

Шин

Y.J.

,

Bell

S.D.

,

Ling

H.

Структурное понимание рекрутирования транслезионной ДНК-полимеразы Dpo4 в скользящий зажим PCNA

.

Мол. Microbiol.

2009

;

71

:

678

—

691

. 21.

Sakurai

S.

,

Kitano

K.

,

Yamaguchi

H.

,

Hamada

K.

,

Okada

K.

,

Fukuda

K.

,

Uchida

M.

,

Ohtsuka

E.

,

Morioka

H.

Структурная основа рекрутирования эндонуклеазы 1 лоскута человека в PCNA

.

EMBO J.

2005

;

24

:

683

—

693

. 22.

Фернандес-Лейро

Р.

,

Конрад

Дж.

,

Scheres

S.H.

,

Ламеры

M.H.

крио-ЭМ-структуры репликативной ДНК-полимеразы E. coli обнаруживают ее динамические взаимодействия со скользящим зажимом ДНК, экзонуклеазой и тау-

.

Элиф

.

2015

;

4

:

e11134

. 23.

Dohrmann

P.R.

,

McHenry

C.S.

Двустороннее взаимодействие полимеразы и фактора процессивности: только внутренний бета-сайт связывания альфа-субъединицы необходим для процессивной репликации голоэнзимом ДНК-полимеразы III

.

J. Mol. Биол.

2005

;

350

:

228

—

239

. 24.

Jergic

S.

,

Horan

N.P.

,

Эльшенавы

М.М.

,

Mason

CE

,

Urathamakul

T.

,

Ozawa

K.

,

Robinson

A.

,

Goudsmit

JM

,

000 Wang

Х.

et al. .

Прямое взаимодействие корректора и зажима стабилизирует репликазу Pol III в режиме полимеризации

.

EMBO J.

2013

;

32

:

1322

—

1333

. 25.

Toste Rego

A.

,

Holding

A.N.

,

Kent

H.

,

Lamers

M.H.

Архитектура комплекса Pol III-зажим-экзонуклеаза раскрывает ключевые роли субъединицы экзонуклеазы в процессивном синтезе и репарации ДНК

.

EMBO J.

2013

;

32

:

1334

—

1343

. 26.

Pillon

M.C.

,

Лоренович

J.J.

,

Uckelmann

M.

,

Klocko

AD

,

Mitchell

R.R.

,

Chung

Y.S.

,

Modrich

P.

,

Walker

G.C.

,

Simmons

L.A.

,

Friedhoff

P.

et al. .

Структура эндонуклеазного домена MutL: нелицензировано на разрез

.

Мол. Ячейка

.

2010

;

39

:

145

—

151

. 27.

Kabsch

W.

Интеграция, масштабирование, назначение пространственных групп и последующее уточнение

.

Acta Crystallogr. D. Biol. Кристаллогр.

2010

;

66

:

133

—

144

,28.

Эмсли

П.

,

Cowtan

K.

Coot: инструменты для построения моделей для молекулярной графики

.

Acta Crystallogr. D. Biol. Кристаллогр.

2004

;

60

:

2126

—

2132

. 29.

Афонин

П.В.

,

Grosse-Kunstleve

R.W.

,

Adams

P.D.

феникс.refine

.

Информационный бюллетень CCP4

.

2005

;

42

: .30.

Krissinel

E.

,

Henrick

K.

Вывод макромолекулярных ансамблей из кристаллического состояния

.

J. Mol. Биол.

2007

;

372

:

774

—

797

. 31.

Sutton

M.D.

Мутант Escherichia coli dnaN159 демонстрирует измененное использование ДНК-полимеразы и хроническую индукцию SOS

.

J. Bacteriol.

2004

;

186

:

6738

—

6748

.32.

Dixon

W.J.

,

Massey

F.J.

Введение в статистический анализ

.